一种高效饲养与显微注射方案用于家蝇Stomoxys calcitrans的遗传改造

摘要

本方案描述了一种可靠的胚胎显微注射方法，用于将外源遗传物质整合到厩螫蝇基因组中，一种通过荧光筛选系统监测注射后胚胎发育的方法，以及一种由添加活性炭的卵黄琼脂培养基组成的幼虫饲养基质，该培养基接种了大肠杆菌（Escherichia coli），可支持从卵到成虫的完整发育过程。

摘要

厩蝇是一种以牲畜、伴侣动物和人类血液为食的害虫，除南极洲外，各大洲均有分布。雌雄成虫的叮咬具有疼痛感，会引发牲畜的应激行为，导致体重下降，给养殖者带来巨大的经济损失。厩蝇雌雄个体均为专性吸血昆虫，这一特性对需要大规模释放雄虫的不育昆虫技术及其他害虫管理策略构成了挑战。目前的厩蝇防治措施往往难以有效控制其种群数量。尽管针对蚊子、Drosophila（果蝇）及其他模式昆虫类群，已开发出多种用于导入外源遗传物质或实现基因敲除的遗传操作方法，但适用于厩蝇的遗传转化技术仍十分有限。本实验方案描述了一种利用高活性piggyBac转座酶变体及一种新型固体幼虫培养基，实现将外源遗传物质高效导入厩蝇的可靠且改进的方法。该培养基可支持胚胎显微注射后的幼虫恢复、孵化、摄食及荧光筛选。

引言

厩蝇（Stomoxys calcitrans L., 1758）是具有重要经济影响的家畜害虫和疾病传播媒介^1,2,3，在全球范围内呈世界性分布。综合害虫管理（IPM）策略往往难以有效控制厩蝇种群^2,3，仅在美国每年造成的经济损失估计就超过20亿美元³。此外，欧洲的厩蝇种群中已记录到杀虫剂抗性现象^4,5，美国也已有相关报道⁶。因此，遗传控制方法（如不育昆虫技术（SIT）和基因驱动系统）可作为对传统IPM项目的有益补充。

此前针对厩蝇遗传控制方法的开发，包括为昆虫不育技术（SIT）构建遗传性别筛选品系，主要依赖选择性育种和辐射诱导的染色体易位^7,8。这些方法劳动强度大，且仅限于非转基因的遗传改良。随后，O'Brochta 等⁹ 证明，利用 Hermes 转座酶系统可将外源基因整合到 S. calcitrans 基因组中；然而，该方案的转化效率较低，仅有约 0.11% 的显微注射胚胎能够产生转基因后代，并且在异源启动子调控下增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标记基因的表达水平较弱⁹。

其他基因操作方法（包括CRISPR-Cas系统）尚未在厩蝇中得到广泛应用，部分原因是难以穿透厩蝇胚胎坚韧的卵壳。这种坚硬的外层卵壳与其他蝇科昆虫的卵壳类似^10,11。尝试使用石英针穿透卵壳或使用双面胶带去除卵壳均未成功，因此必须采用氧化溶液（3%次氯酸钠，NaOCl）处理，但该处理会降低卵的孵化率。

在实验室条件下可长期维持厩蝇的培养，其未成熟阶段通常在发酵的纤维素类基质中饲养，例如木屑、麦麸或稻草，并添加氮源，如小牛蛋白补充剂或鱼粉¹²。然而，当用于培养显微注射后的胚胎时，这些基质存在若干缺点。由于其不透明性和高自发荧光性，幼虫孵化后钻入基质中，难以识别表达GFP的阳性幼虫。此外，尽管幼虫存活需要一定量的细菌存在¹³，但发酵基质会引入不可预测的细菌和真菌群落，可能在孵化前损伤或吞噬胚胎。这些局限性导致使用先前报道的注射和饲养方法无法成功获得转基因幼虫⁹，凸显了建立一种更可靠的注射方案的必要性，该方案还需支持在整个发育过程中进行荧光筛选。

本文介绍了一种可重复的显微注射方案，该方案在转座酶选择、注射方法以及筛选和饲养培养基方面进行了优化。这些改进有助于开发基因修饰的稳定蝇株，可用于包括昆虫不育技术（SIT）中的遗传性别筛选品系、基因驱动系统以及CRISPR-Cas介导的基因敲除等应用。关键改进包括：使用热激蛋白（hsp）83启动子调控的高活性piggyBac转座酶¹⁴，通过胚胎脱水以减少注射后原生质流失，以及在胚胎注射过程中取消使用胶带和卤代烃油。

通过使用接种了大肠杆菌（Escherichia coli）菌苔的扁平、有色营养琼脂平板替代批量培养基，进一步提高了注射后胚胎的回收效率。这种琼脂配方具有两个主要优势：第一，它为幼虫发育提供了可预测的单基因型细菌食物来源；第二，它提供了高对比度、低自发荧光的背景，便于观察形态、发育过程以及第一代（G0）幼虫中的GFP表达。家蝇和厩蝇在接种大肠杆菌（E. coli）的蛋黄基琼脂平板上能够正常发育并化蛹^13,15。本文所述配方中加入了活性炭粉末作为一种非反应性、食品级添加剂，以进一步降低背景荧光。

方案

所有实验和操作均获得德克萨斯农工大学机构动物照护和使用委员会（IACUC）的批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护和使用指南》中的规定。&M 的机构生物安全委员会（方案编号 IBC2019-081）。本方案中使用的试剂、化学品和工具列于下文 材料表.

1. 卵生产果蝇的饲养

1. 准备成虫培养笼
   1. 将培养箱的恒温器设定为 28°C，在一个 10 L 的容器中将 3 kg 氯化钠与约 5 L 自来水混合，溶解约 50% 的盐。
   2. 将此敞口盐水盘置于培养箱腔室底部，以维持约80%相对湿度。在培养箱或房间内保持16小时光照与8小时黑暗的昼夜循环。
   3. 在昆虫饲养笼（30 × 30 × 30 cm 不锈钢/铝制带网纱笼）底部铺上两层纸巾，并在纸巾层上放置一个装满颗粒状食用糖的45 mL一次性调味杯（图1A).
      注意： 纸巾有助于吸收果蝇的排泄物，糖则在果蝇吸血前为其提供食物来源。
   4. 将约100 mL室温自来水倒入250 mL Griffin烧杯中，取一块20 cm × 20 cm的黑色棉布（可裁自普通黑色枕套或床单），将其浸入水中并压入水中直至完全润湿。调整黑色棉布位置，使其边缘超出烧杯口沿1–2 cm图1B).
      注意： 这种湿润的布料为成虫果蝇提供液态水和产卵表面。若成虫无法接触到水源，可能会迅速死亡。
   5. 将500–1,500个稳定的蝇蛹转移至小培养皿或烧杯中，并放入昆虫饲养笼内。将成虫饲养笼置于湿润的饲养室中（步骤 1.1.1）并每日观察羽化情况。成虫羽化后，开始每日饲喂柠檬酸抗凝的牛血（第1.2节).
2. 喂食成年果蝇
   1. 通过向新鲜采集的牛血中加入终浓度为10.9 mM的柠檬酸三钠二水合物，制备枸橼酸盐抗凝牛血。
   2. 简而言之，将约12.8克柠檬酸盐溶于少量去离子水中，加入从当地屠宰场采集的4升血液中。
      注意： 血容器应配有螺旋盖（例如，方形、广口、4L 握柄瓶），并在使用前用温肥皂水彻底清洗。在屠宰场采集牛血时，应避免收集屠宰后最初约 1 升的血液，以尽量减少毛发、汗液、污物及其他促凝物质的污染。
   3. 将柠檬酸抗凝的牛血以200 mL分装冻存，按需解冻，解冻后的分装样品可在4°C冷藏保存最多一周。
   4. 每600只果蝇的成虫笼提供约40 mL室温血液。
   5. 血液可置于调味品容器或烧杯中，并将折叠的非无菌棉纱布浸入容器内以吸收血液。轻轻搅动棉纱布，直至其完全浸透，然后将其放入笼内。
      注意： 羽化后24小时开始，应每日更换血液。
3. 卵的收集
   1. 一旦在黑色棉布上观察到卵，立即将布从烧杯中取出，并使用洗瓶将卵冲洗至另一个约700 mL的浅口塑料容器中图2A产卵通常发生在果蝇7-10日龄时。
      注意： 检查血杯中是否有虫卵，并收集可能落入其中的散在虫卵。
   2. 在滤纸上收集卵 通过 真空过滤。将黑色滤纸置于布氏漏斗中，施加真空，然后将卵液倒入 步骤 1.3.1. 超过设置。
   3. 随后，使用洗瓶将卵转移至量筒或带刻度的1.7 mL微量离心管中，并记录所收集卵的体积（图2B).
      注意： 避免将卵长时间浸入水中，因为浸入约10分钟后死亡率即开始上升。
4. 批量幼虫培养基的制备
   1. 收集大量幼虫培养基所需的材料（图3A)，如所述 表1.
   2. 在1000 mL烧杯中，加入小牛蛋白补充剂和全部自来水，在室温下静置过夜使其充分水合。
   3. 将麦麸和蛭石加入另一个较大的混合容器中。
   4. 过夜复水后，充分搅拌复水的犊牛补充剂以打散结块，然后将混合物倒入盛有麦麸和蛭石的容器中。彻底混合至均匀，确保所有麦麸均被犊牛补充剂浆液包裹。
   5. 将大量培养基转移至聚丙烯食品储存容器中，铺成约 8 cm 深、覆盖整个容器底部的均匀层（图3B).
   6. 加入约 1,000 个胚胎（每 2.2 L 大体积培养基加入约 0.2 mL 卵） 通过。使用直径为90 mm的圆形滤纸进行真空过滤，然后将带有虫卵的滤纸正面朝下放置于培养基盒中央（图3B，C).
   7. 用约 1 cm 的培养基覆盖滤纸以保持湿润（图3C）并用一块较大的黑色棉布覆盖容器，棉布需超出容器边缘5厘米。
   8. 在食品容器的盖子上切一个大孔（直径约12 cm），以利于气体交换，并将盖子扣紧在培养基盒上，同时将黑色棉布边缘夹在容器与盖子之间图3D).
      注意： 这起到垫圈的作用，防止盖子与容器之间的缝隙滞留液体。^st 凝结水滴中的龄期幼虫。
   9. 将配制好的培养基放入成虫饲养室中的培养盒内，直至化蛹，并持续观察幼虫发育情况（图4（化蛹时间约为10天，具体取决于培养基温度和幼虫密度）。
      注意： 覆盖的布料应足够细密，以防止一龄幼虫穿过，同时应具有足够的透气性，以避免培养箱内壁形成冷凝水，否则可能困住并淹死幼虫。
5. 蛹的分离
   1. 移除蛹盒上的覆盖布，用勺子或铲子收集蛹。
      注意： 稳定蝇的蛹呈不活动的红褐色圆柱体，长度为4-7 mm，与可活动的黄白色幼虫明显不同。在蝇类开始从幼虫经蛹变为成虫的变态过程中，蛹通常聚集在容器壁的外周区域，或其培养容器内潮湿且较高的位置。
   2. 将500–1,500只蛹以约1 cm深度平铺于培养皿中，按1.1节所述方法置于新的洁净笼中，以繁育下一代。

图1：成蝇饲养材料。（A）成蝇饲养笼，显示蔗糖杯（S）和产卵杯（O）。（B）产卵杯中装有吸水饱和的黑色棉布，棉布略超出烧杯边缘。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：卵的收集。（A）使用洗瓶从产卵布上收集卵。（B）通过真空过滤将卵收集到高对比度滤纸上。请点击此处查看该图的放大版本。

大规模幼虫培养基材料
试剂	质量（g）
水	900
小麦麸皮	230
犊牛补充剂	100
蛭石（A4 粗粒）	70
去膜溶液所需材料
溶液	组成
氧化浴	3% 次氯酸钠水溶液（溶剂为去离子水）
清洗浴液	去离子水中含 0.02% 的 Triton X-100 溶液
冲洗	去离子水
黑色琼脂筛选与饲养平板材料
试剂	质量（g）
水	500
蛋黄粉	18
活性炭	4
氯化钠	1

表1：批量幼虫培养基、去卵壳溶液和黑色琼脂平板的试剂。 用于制备批量幼虫培养基以维持种群，以及用于软化和去除稳定蝇胚胎卵壳的溶液成分，还包括制备500 mL黑色琼脂筛选与饲养培养基所需的材料。

图 3：大量幼虫培养基的制备。 （A）用于制备大量幼虫培养基的材料：小牛蛋白补充剂（CM）、麦麸（WB）、蛭石（VM）、储存容器（SC）、盖子（L）和织物垫圈（FG）。（B）培养基组分的充分混合。（C）将带有卵的滤纸（EP）正面朝下放置在培养基表面，并覆盖额外的培养基以防止干燥。（D）在容器和盖子之间安装棉布垫圈。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：幼虫在散装培养基中的发育。 透明容器便于观察幼虫发育情况及培养基状态。幼虫（L）可见于容器壁、盖子以及培养基内部。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 注射前准备：去壳与干燥

1. 按照步骤 1.1.4所述，将一块湿润的黑色棉布放入烧杯中，并转移至成虫饲养笼内放置 25 分钟以收集卵。使用洗瓶将卵冲洗至一个 106 µm 的不锈钢筛网上。
   注意：25 分钟的收集时间通常可获得约 400 个卵。
2. 让胚胎在筛网上静置，不受干扰地继续发育 30 分钟。
3. 在胚胎老化的同时，分别准备 150 mL “脱膜溶液材料”部分（表 1，图 5）中所述的氧化溶液、洗涤溶液和漂洗溶液。使用足够的体积，使溶液液面高出胚胎约 1 cm。
4. 将装有胚胎的筛网浸入氧化浴中 2 分钟，并使用巴斯德移液管轻轻搅动胚胎（图 6A）。
   注意：反复吸液和排液以形成环形涡流，有助于将胚胎集中于筛网中央，并防止刚脱膜的胚胎黏附在筛网壁上。
5. 将筛网从氧化浴中取出，轻敲以去除多余溶液。将筛网转移至洗涤溶液中，并通过吸液和排液方式搅动 2 分钟。
6. 将装有胚胎的筛网转移至漂洗溶液中，并按照步骤 2.4所述方法搅动 2 分钟。从漂洗溶液中取出筛网，轻敲以去除多余水分。
7. 在筛网上放置一片无菌玻璃盖玻片，在解剖显微镜下使用细尖尼龙画笔将胚胎（图 6B）从筛网转移至盖玻片边缘。将胚胎紧密排列但互不接触，使较宽的后极朝向盖玻片边缘。转移过程中避免弯曲、扭曲或撕裂胚胎。
8. 通过在 1 L 三角瓶底部铺入 100 mL 硫酸钙干燥剂，并用橡胶塞密封，制备干燥室。
   注意：在 23 °C 下平衡 24 小时后，干燥室内的相对湿度通常可降至<5%。
9. 去除盖玻片上的多余水分，将带有脱膜胚胎的盖玻片置于干燥剂上。重新用橡胶塞密封三角瓶，干燥胚胎 8 分钟。
10. 将盖玻片从干燥室中取出，放置于显微镜载物台上，在 20× 物镜下进行显微注射。

图 5：去卵膜溶液。 从左至右：不锈钢筛网、氧化溶液、洗涤溶液和用于胚胎去卵膜的漂洗溶液。次氯酸钠以6%的储存液形式避光保存，Triton X-100以10×储存液形式保存，使用前稀释至终浓度为0.02%。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：胚胎去壳操作。（A）轻柔地吸液和排液可产生涡流，使胚胎集中在筛网中央，并减少胚胎与筛网壁的黏附。（B）清洗后，去壳的胚胎从半透明的卵壳中孵出。通常情况下，前端（较窄的一端）先于后端孵出。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 显微注射

1. 使用 表2 中列出的参数，从100 mm带丝玻璃毛细管（内径0.7 mm，外径1.0 mm）中拉制石英显微注射针。将针头存放于无尘环境中，直至使用。
   注意： 几何形状相似的硼硅酸盐玻璃针也可使用。
2. 制备注射缓冲液（含0.1% w/v酚红的磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4），并通过0.22 µm注射器滤器过滤除菌。
3. 通过将各10 µg的piggyBac辅助质粒和供体质粒（其携带位于左右piggyBac反向末端重复序列之间的遗传载荷）与4 µL注射缓冲液混合，配制20 µL注射混合液。用无核酸酶水稀释至终浓度为500 ng/µL。
   注意： 辅助质粒包含位于hsp83起始密码子上游的3.1 kb hsp83启动子序列以及高活性piggyBac转座酶编码序列。
4. 将注射混合液转移至低体积0.20 µm PTFE注射器滤器中，并将滤器插入0.5 mL微量离心管开口内（图7A）。在≥11,000 x g条件下离心10分钟，或直至全部注射混合液通过滤器。未使用的注射混合液储存于-20 °C。
5. 使用微量凝胶加样枪头向石英显微注射针后部填充约2 µL注射混合液（图7B）。加样过程中避免引入气泡。
   注意： 将显微注射针方向与胚胎长轴平行，并保持水平和垂直角度无偏移，以尽量减少撕裂和剪切损伤。
6. 轻轻敲击针尖至玻片边缘，直至注射混合液从针尖流出（图7C）。
   注意： 逐步折断针尖，形成尽可能小且锐利的开口，同时仍允许注射混合物流动。
7. 在胚胎脱水后立即通过后极进行注射，注射压力约为700 hPa，回吸压力约为300 hPa。
8. 轻柔刺入胚胎，并注入约相当于胚胎体积十分之一的注射混合液（图7D–F）。
   注意： 尽量减少针头穿刺深度，以降低对卵黄膜的扰动，并防止拔针时卵质流失。
9. 注射后立即将盖玻片转移至铺有无菌湿润90 mm黑色滤纸的培养皿中，在室温下孵育48 h。
   注意： 所有注射操作应在产卵后2 h内完成，以确保靶向处于合胞体阶段前的胚胎。
10. 每12–16 h检查一次胚胎孵化情况。将新孵化的幼虫连同玻璃盖玻片转移至按第4节所述方法制备的接种并预平衡的琼脂平板上。

参数	加热	填充	速度	延迟	回抽
数值	825	5	60	150	175

表2： 拉针参数。 用于制备石英显微注射针的参数。

图 7：胚胎显微注射。（A）使用嵌套在0.5 mL微量离心管中的注射器滤器过滤注射混合物。（B）使用加样枪头将过滤后的注射混合物装入显微注射针中。（C）石英显微注射针的末端几何结构。（D）将注射针与胚胎后极对齐。（E）穿透胚胎表面，同时尽量减少对卵黄膜的扰动。（F）注入约相当于胚胎体积十分之一的液体，随后撤出针头。透明度增加表明注射混合物已置换卵质。比例尺 = 400 µm（D–F）请点击此处查看该图的放大版本。

4. 处理板的制备

1. 琼脂培养基配方
   1. 制备表1中“黑色琼脂筛选与饲养平板材料”部分所述的培养基，在121 °C下高压灭菌15分钟。在40 °C时倒平板，或在室温下储存，待重新加热后分装至90 mm的培养皿中。
      注意：倒平板前需剧烈摇晃，以重新悬浮固体颗粒。
2. 平板接种
   1. 将K12大肠杆菌（Escherichia coli）的24小时培养物用LB液体培养基稀释至OD600 = 0.200，取200 µL滴加到已冷却凝固的琼脂平板上。使用无菌玻璃珠或玻璃涂布器将菌液均匀涂布，并让平板吸收多余液体（图8A，B）。
      注意：琼脂平板应在倒制后1个月内使用，过期应丢弃，以确保细菌和幼虫的稳定生长。
3. 平板预处理
   1. 将6 × 6 cm的黑色滤纸折叠成6–10条波纹状褶皱，通过烘烤或高压灭菌进行灭菌。将一片无菌的波纹滤纸无菌操作放置于接种后的培养皿中，并用数滴无菌水润湿（图8C）。
   2. 对未经处理、未注射的野生型（WT）一龄幼虫进行表面灭菌，将10只幼虫转移至湿润的滤纸上。
      注意：通过将WT胚胎浸入10%次氯酸钠溶液（0.6% NaOCl）1分钟，随后用无菌去离子水冲洗2分钟，以实现胚胎表面灭菌。
   3. 在培养皿盖与皿体之间放置一张90 mm的滤纸，作为密封垫片。
   4. 在加入载有注射胚胎的玻璃盖玻片前，让WT幼虫在平板上预处理24小时（图8C）。待首批注射的胚胎孵化后，移除WT幼虫。

图8：琼脂平板制备与注射后回收。（A）使用无菌玻璃珠将OD600 = 0.2的Escherichia coli菌液接种至琼脂平板上。（B）胚胎转移前吸收表面多余水分。（C）在培养皿盖与皿体之间放置一张90 mm的滤纸垫圈。（D）在条件化琼脂平板上筛选带有荧光标记的幼虫。注射后的胚胎被回收至倒置培养皿盖内、经去离子水饱和的90 mm滤纸上，于转移至筛选平板前孵育48小时。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

采用本方案，对431个家蝇胚胎进行了去壳处理，并注射了终浓度为500 ng/µL的 piggyBac-Hsp83供体质粒和Hsp83辅助质粒。在注射后的431个胚胎中，有18个呈ZsGreen阳性的幼虫（4.2%）和8个呈ZsGreen阴性的幼虫（1.9%）在注射后48–76小时孵化，筛选时使用黑色碳琼脂平板（表3）。总体而言，431个注射胚胎中有26个成功孵化（6.0%），其中26个孵化幼虫中有16个存活至成虫阶段（61.5%）。

物种	注射类型	载体构建	注射数量	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) 蛹	ZsGreen(-) 蛹	ZsGreen(+) 成虫	ZsGreen(-) 成虫	产生 ZsGreen(+) 后代的成虫数量
Stomoxys calcitrans	转座酶插入	Hsp83:hy-pBac (辅助质粒, 500 ng/µL) Hsp83: zsGreen (供体质粒, 500 ng/µL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	转座酶插入	Hsp83:hy-pBac (辅助质粒, 500 ng/µL) Hsp83: zsGreen (供体质粒, 500 ng/µL)	205	13	0	7	0	7	0	5

表3： 显微注射统计结果。 胚胎显微注射后的存活率、转化率和复苏率。

在18只ZsGreen阳性的G0幼虫中，有12只存活至化蛹阶段（66.7%），其中10只羽化为成虫。6只ZsGreen阳性的成虫（占注射胚胎的1.4%，可育G0存活个体的60%）产生了ZsGreen阳性的后代。这些后代（图9A–E）经自交繁殖，在撰写本文时其荧光性状已稳定遗传至第六代。

在八只ZsGreen阴性幼虫中，有六只存活至成虫阶段（75%）。所有无荧光的成虫均未产生具有荧光的后代。

图 9：转基因果蝇的荧光筛选。（A）表达 ZsGreen 的 F1 代幼虫与野生型（WT）幼虫的比较。（B）通过蛹体壁可见荧光，可在蛹期进行转基因个体的筛选。（C,D）在白光（C）和荧光（D）照射下，三个表达 ZsGreen 的幼虫和蛹（左侧）与三个野生型幼虫和蛹（右侧）的比较。（E）表达 ZsGreen 的成年转基因 F1 代果蝇（左侧）与野生型成年果蝇（右侧）的比较。比例尺 = 1 mm（A），2 mm（B,E），3 mm（C,D）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

非模式昆虫物种的遗传转化仍是节肢动物害虫和媒介遗传防控策略研发与评估中的主要瓶颈。

对于厩蝇，本文所述方案减少了胚胎显微注射后G0代蝇的注射、饲养所需的时间、资源、人力以及变异性。此外，使用黑色琼脂筛选平板可直接观察其整个生命周期的发育过程，有助于在注射、复苏及幼虫饲养过程中及时发现并纠正出现的问题。利用本研究中评估的质粒构建体，该方案相比以往报道的方法，仅需更少的注射胚胎数量即可获得转基因厩蝇品系⁹。尽管确认和定位转基因插入位点超出了本方法学文章的范围，但可采用已建立的技术如反向PCR和splinkerette PCR进行分析。

高效的显微注射方案还有助于推动功能基因组学领域的后续研究，包括利用荧光报告基因进行启动子功能表征；通过反向遗传学方法分析与病原体传播相关的基因，以评估媒介传播能力；对核酸酶进行表征，包括在稳定转基因家蝇中评估CRISPR-Cas9及其他可编程核酸酶的活性；通过修饰候选抗性等位基因开展杀虫剂抗性研究；以及开展基础生物学研究，如参与吸血、交配和发育过程的基因功能研究。本方案还省去了以往家蝇（Musca domestica）和绿头蝇（Lucilia cuprina）piggyBac转基因研究中所必需的油浸胚胎注射以及注射后胚胎恢复所需的充氧高湿培养环境^16,17。

多个参数对成功实现转基因至关重要。其中，胚胎脱水和显微注射时机尤为关键，因为质粒DNA必须在细胞化之前导入，以确保其能够整合到生殖系前体细胞中。然而，家蝇胚胎中合胞体形成的精确时间尚不清楚。此外，胚胎发育速率受温度影响，而不同环境条件下家蝇胚胎的发育时间线尚未被充分表征。未来针对稳定品系家蝇实验室种群的发育速率及胚胎发生过程的研究，可能为优化显微注射和转化方案提供依据，从而进一步提高实验效率和方案的可重复性。但在目前阶段，确定最佳注射时间窗口仍是一个方法学上的限制因素，可能影响转化效率。当存活率较低时，可通过比较未处理胚胎、去壳膜胚胎、注射滤膜灭菌PBS的胚胎以及在琼脂平板上培养的野生型（WT）胚胎的孵化率和成虫存活率来进行故障排查。此前文献报道，对家蝇（Musca domestica）进行1,668次注射获得了14个整合事件（占注射总数的0.84%）¹⁶；对羊蛆蝇（Lucilia cuprina）这一绵羊害虫的转化研究中，约900次胚胎注射建立了3个转基因品系（占注射总数的0.33%）¹⁷。相比之下，本方案中描述的家蝇转化实验在431次注射中获得6个整合事件（占注射总数的1.4%），表明其注射效率优于文献中其他双翅目害虫物种的转化效率。

稳定蝇的 hsp83 组成型启动子在整个发育过程中提供了ZsGreen的强效表达，并在早期胚胎发生期间支持了高活性piggyBac转座酶的表达，从而与先前报道的稳定蝇转化方案相比，提高了荧光标记的可见性和转化效率⁹。本研究中使用的辅助质粒是通过将紧邻hsp83起始密码子上游的3.1 kb基因组DNA片段亚克隆至最小质粒载体中、位于高活性piggyBac转座酶编码序列上游而构建的。辅助质粒与载体质粒的质量比经经验确定为1:1，并在整项研究中沿用该比例。尽管未评估其他质粒比例，但其他比例也可能有效。

本文所述的改进方法可能适用于其他节肢动物的转基因方案。此外，基于琼脂的筛选与饲养系统目前正应用于黑水虻（Hermetia illucens）胚胎的显微注射与筛选。该方案可能对其他蝇科蝇类（如家蝇（Musca domestica）和牛蜱蝇（Haematobia irritans））的转基因研究特别有用，因其幼虫生态及在腐烂纤维基质中的发育过程相似。使用接种大肠杆菌（Escherichia coli）的琼脂平板，可在注射后提供一种实用的监测方法，使研究人员能够评估胚胎发育、幼虫形态、标记基因表达、孵化率及整体存活率。根据目标物种的生物学特性调整培养基中的细菌成分，可能进一步提升该方法在建立和优化转基因方案中的应用价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带橡胶塞的1 L烧瓶（干燥室）	VWR	214-1134	干燥室
Bacto Agar	Difco	281230	黑色琼脂平板用琼脂
黑色枕套	Aisawate	3.45496E+11	用于卵收集杯的黑色棉布及幼虫培养箱的织物垫圈
硫酸钙干燥剂	Drierite	21001	干燥室用干燥剂
犊牛营养补充剂（Calf Manna Performance Supplement）	Manna Pro	095668940010	大量幼虫培养基
体视显微镜	Leica Microsystems	DM750M	注射用显微镜
干燥蛋黄粉	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	黑色琼脂平板的营养来源
E. coli	New England Biolabs	C2987H	用于黑色琼脂平板的细菌
Femtojet 4i 显微注射压力供给装置	Eppendorf	5252000021	显微注射压力供给装置
细尖尼龙画笔	Transon	7.42298E+11	转移胚胎
火焰抛光石英毛细管（带丝，外径1.0 mm，内径0.70 mm，长10 cm）	World Precision Instruments	QF100-70-10	拉制针头用毛细管
镊子	Fine Science tools	11251-20	样品操作
全高筛，直径3”，No. 140 ASTM-E11标准试验筛（106 μm）	Cole-Parmer	UX-59987-24	去壳期间固定胚胎
杀菌超浓漂白剂（6%次氯酸钠）	Pure Bright	59647-21014	去除卵壳的漂白液
GladWare 家庭装食品储存容器，XL 104 oz	Glad	012587701294	大量幼虫培养基容器
Grade 8613，9 cm 黑色定性滤纸	Ahlstrom	8613-0550	收集胚胎
LB肉汤	BD Difco	DF0446-17-3	用于E.coli培养的LB肉汤
配备Leica Ergo目镜管的M60变倍体视解剖显微镜	Leica Microsystems	SP-M60-TS	用于移动和排列胚胎的显微镜
Microloader吸头，0.5–20 μL，100 mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	用于将注射混合液装入针头
显微操作仪	Leica Microsystems	11520137	注射用显微操作仪
Millex注射器滤器，亲水性PTFE，0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	用于过滤注射混合液
无核酸酶水	Corning	46-000-CM	注射缓冲液
有机椰壳活性炭粉末	Belle Chemical	B073BSNLJ3	黑色琼脂平板的色素
基于激光的P-2000毛细管拉制仪	Sutter Instruments	P-2000/G	用于从毛细管拉制针头的设备
PBS，pH 7.4	Gibco	10-010-023	注射缓冲液
培养皿	VWR	391-0609	用于琼脂黑色卵板的培养皿
酚红，CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	注射用染料
橡胶塞	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	干燥室密封塞
软质小麦麸皮（软红冬小麦），50磅	Siemer	55600050500000	大量幼虫培养基
方形玻璃盖玻片，18×18 mm	Alkali Scientific	SM1818	显微注射用玻璃盖玻片
体视显微镜荧光适配器	Nightsea	SFA-RB	用于幼虫筛选的荧光灯和滤光片
无菌玻璃珠	VWR	1.04016.0500	将细菌涂布于平板
一次性移液管，5 mL	LabAid	BP1200	去壳过程中清洗胚胎
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	胚胎去壳处理
洗瓶	Safetyware	Z423335	从表面冲洗胚胎