异氟烷辅助电针治疗少弱精症大鼠模型

摘要

本方案详细描述了建立腺嘌呤诱导的大鼠少弱精子症模型的方法，以及在异氟烷麻醉下对CV3、CV4、ST36和SP6穴位进行电针干预的操作。通过计算机辅助精子分析检测精子数量和活力，并结合苏木精-伊红染色的睾丸组织学检查来验证实验结果。

摘要

少弱精症是男性生殖功能障碍最常见的形式之一。在啮齿类动物研究中，反复多次实施电针治疗存在技术上的挑战，尤其是在同时刺激腹部中线和后肢穴位时，电极接触的稳定性至关重要。本研究选择中极（CV3）、关元（CV4）、足三里（ST36）和三阴交（SP6），因为这些穴位在治疗不孕症和精液异常的针灸方案中经常使用，且腹部中线联合后肢的电极配置适用于标准化的电极配对。本文介绍了一种实用的实验方案，用于建立腺嘌呤诱导的少弱精症大鼠模型，并在异氟烷辅助下对CV3–CV4和ST36–SP6穴位对进行电针治疗。雄性Sprague-Dawley大鼠通过每日灌胃给予腺嘌呤，持续28天，以诱导生殖功能损伤。随后，在吸入麻醉条件下每日实施电针治疗，持续28天；麻醉诱导使用3%异氟烷，维持使用1.5%异氟烷面罩给药，以确保针刺定位和电极配对（CV3–CV4和ST36–SP6）的稳定性，并采用设定的刺激参数（2 Hz，1.5 mA，30分钟）。通过计算机辅助精液分析评估精子数量和活动力，并结合睾丸组织苏木精-伊红（HE）染色进行组织学分析，以评价治疗效果。代表性结果表明，腺嘌呤暴露可导致精子数量和活动力下降，并破坏生精小管结构；而电针治疗则与精液参数及睾丸组织形态的部分恢复相关。该方案为在少弱精症大鼠模型中开展需要稳定电针干预并进行精液学和组织学验证的研究提供了可直接参考的操作流程。

引言

男性因素在不孕症中起着重要作用，约半数不孕夫妇存在男性因素，其中精子数量和活力异常是最常见的临床发现^1,2。少弱精子症以精子浓度降低和运动能力受损为特征，是男性生殖功能障碍中最常见的类型之一^3,4。尽管辅助生殖技术和经验性药物治疗已广泛应用，但有效改善精液质量的策略仍然有限，凸显了进一步开展临床前研究的必要性^5,6,7。这些临床和转化医学需求推动了在受控条件下研究男性生殖功能障碍的可重复实验流程的建立。

针灸干预在临床和实验背景下均已被用于研究精液异常和男性不育⁸。尽管临床研究表明针灸可能对某些精液参数具有改善作用，但这些研究的设计、干预方案和结局指标存在广泛差异⁹。电针（EA）尤其适用于实验室研究，因其能够提供可控的刺激参数，并比手工针灸实现更均一的调控，从而有助于评估治疗对可测量生殖结局的影响^10,11,12。这一操作优势使电针非常适用于男性生殖研究中的结构化临床前工作流程。

动物模型在上述评估中具有核心作用，但在少弱精症研究中，模型的选择仍然是一个关键的方法学问题。最近的一项系统综述指出，白消安诱导的建模方法存在争议，且在评价指标方面表现出显著的异质性，凸显了建立更清晰操作流程和更一致检测指标的必要性¹³。基于腺嘌呤的模型提供了一种可行的实验方法，因为通过灌胃给予腺嘌呤可诱导大鼠生殖功能障碍，包括精子相关指标减少以及睾丸组织的组织学损伤^14,15。在我们先前的研究中，采用电针（EA）干预腺嘌呤诱导的少弱精症大鼠模型，选穴为俞募配穴脑-肾组（Epangsanxian、BL23、GB25 和 KI3），并设置非穴位点和阳性药物对照组，检测指标进一步扩展至器官系数及通过ELISA定量测定的血清激素水平¹⁶。在该实验基础之上，鉴于现有电针研究中在穴位选择、对照设计、刺激参数和结局指标等方面存在较大异质性，本实验方案旨在优化并拓展稳定电针干预的方法学流程。

因此，本实验方案重点关注电针刺激的递送过程，针对在啮齿类动物中重复进行电针治疗的两个关键实践变量进行优化。首先，为防止动物活动和导线牵拉导致的针头移位及电极接触不稳定，我们描述了一种以异氟烷维持麻醉的方法，可在刺激期间稳定动物体位，确保各次治疗过程中电极接触的可靠性；当联合使用腹部正中线穴位与后肢穴位时，这一点尤为重要。其次，基于既往综述及穴位处方分析^9,17，CV4、SP6、ST36 和 CV3 被确定为不孕症及精液异常治疗方案中常用的生殖相关穴位，因此我们选取 CV3、CV4、ST36 和 SP6，并对 CV3-CV4 及 ST36-SP6 进行配对刺激。该配穴方式结合了腹部正中线与后肢穴位，可标准化电极连接方式，减少因导线连接不稳定引起的变异，从而在多次重复治疗中实现可重复的电针递送。为保持方案的聚焦性，并避免重复已报道的内分泌、机制或阳性对照模块，结果验证仅限于一组核心的精液与睾丸指标检测，包括计算机辅助精子分析和睾丸组织苏木精-伊红（HE）染色，足以确认本流程中表型的成功诱导及治疗相关变化。

方案

所有动物实验均遵守实验室动物护理与使用的机构指南，并经宁夏医科大学伦理委员会批准（批准号：IACUC-NYLAC-2021-130）。8周龄、体重180–220 g的雄性Sprague-Dawley大鼠购自宁夏医科大学实验动物中心（许可证号：SYXK (宁) 2020-0001）。动物饲养于标准实验室条件下，温度为22–24 °C，相对湿度为52%–56%，光照周期为12 h光照/12 h黑暗，可自由摄食和饮水。

1. 动物准备、分组及腺嘌呤诱导模型的建立

1. 实验前将大鼠适应性饲养7天，并每日观察其一般状况。
2. 适应性饲养结束后，为9只大鼠分配唯一的编号，并通过计算机生成的随机序列按1:1:1的比例随机分为三组：对照组（n = 3）、模型组（n = 3）和电针组（EA组，n = 3）。以每只大鼠为实验单位，所有动物及样本均纳入最终分析，除非符合预设的排除标准。
3. 对进行计算机辅助精液分析和组织学评估的研究人员实施盲法处理，使其不知分组情况。
   注：实施电针干预的研究人员无法设盲，因该干预涉及可见的组别特异性操作。
4. 用含0.5%（w/v）阿拉伯胶作为助悬剂的生理盐水配制20 mg/mL的腺嘌呤混悬液，并在灌胃前及操作过程中充分混匀，以防止沉淀。
5. 对照组给予生理盐水，模型组和电针组给予腺嘌呤混悬液，按10 mL/kg（相当于1 mL/100 g体重）剂量每日灌胃一次，连续28天。腺嘌呤给药剂量为200 mg/kg/天。
6. 在整个造模期间记录大鼠体重及一般状况。
   注： 腺嘌呤以混悬液形式给药，在操作过程中易发生沉淀。灌胃期间应持续震荡以减少沉淀，否则可能导致给药剂量不一致或堵塞灌胃针。若发生堵塞，应重新充分混悬溶液，并更换灌胃针后继续操作。

2. 电针递送的异氟烷麻醉（图1）

1. 准备一套异氟烷麻醉系统，包括诱导室、鼻罩和加热垫。
2. 在诱导室内使用3%异氟烷进行麻醉诱导，直至自发活动明显减少。
3. 将大鼠转移至加热垫上，保持仰卧位，并通过鼻罩持续给予1.5%异氟烷以维持麻醉状态，贯穿电针（EA）全过程。
4. 通过观察自发运动减少及角膜反射消失，同时保持规律呼吸，确认麻醉深度足够。

3. 刺激递送的保真度与质量控制

1. 使用加热垫在整个实验过程中维持体温，以减少因低体温引起的生理变异。
2. 所有动物和实验均采用一致的麻醉条件：诱导麻醉使用 3% 异氟烷，维持麻醉使用 1.5% 异氟烷。保持麻醉深度在防止动物挣扎所需的最低水平，同时维持规律呼吸。
3. 将无菌一次性针灸针（0.25 mm × 13 mm）垂直插入选定的穴位。进针深度分别为：CV3 和 CV4 约 2 mm，ST36 约 7 mm，SP6 约 5 mm。
4. 针插入并连接电极后，目视确认每根针保持稳定位置，无因呼吸或肢体运动导致的松动。若发生移位，应将针垂直重新插入至原定深度，并在恢复刺激前确认电极接触稳定。
5. 将电极导线夹在针柄近端，然后布线并固定，以尽量减少牵拉；导线重量和拉扯是导致脱落的常见原因。
6. 通过观察穴位局部出现轻微肌肉震颤但无明显全身运动来确认有效刺激。若未见震颤，需重新检查并确认电极接触和针的位置。
7. 在实验进行至 15 分钟时，进行一次标准化检查。如有必要，调整针的位置，并在继续实验前重新确认局部轻微震颤，以减少不同动物间刺激传递的变异性。
   注意：连接电针仪时，应将导线夹在针柄近端，以减少导线重量带来的牵拉。必要时可用胶带固定导线和/或针，防止实验过程中脱落。

4. 电针治疗（图2）

1. 在连续28天腺嘌呤灌胃结束后次日开始电针干预，每日施治一次，连续进行28天。
2. 在异氟烷麻醉下，暴露下腹部及后肢，依据体表解剖标志定位中极（CV3）、关元（CV4）、足三里（ST36）和三阴交（SP6）。
3. 将无菌一次性针灸针（0.25 mm × 13 mm）垂直刺入，CV3和CV4进针深度为2 mm，ST36进针深度为7 mm，SP6进针深度为5 mm。
4. 将一对电极连接至CV3与CV4，另一对电极连接至ST36与SP6。
5. 以2 Hz频率、1.5 mA强度进行30分钟电刺激。该参数设置与先前用于腺嘌呤诱导的少弱精子症模型的研究一致¹⁶。
6. 按照第3节所述实施质量控制措施，包括在治疗进行至15分钟时进行一次中途检查。
   注意：大鼠穴位定位可参考雍棠《实验针灸灸法学》¹⁸附录II“实验动物常用穴位”，并结合比较解剖学标志进行确定。由于大鼠穴位代表的是特定解剖区域而非固定的几何点，因此需在不同动物及实验过程中保持一致的体位、固定的解剖参照点以及基于毫米单位的体表测量。中极（CV3）位于腹侧正中线上，约在脐中心尾侧33 mm处；关元（CV4）位于腹侧正中线上，约在脐中心尾侧25 mm处，靠近腹壁浅表皮下动脉；足三里（ST36）位于膝关节后外侧，腓骨小头远端约3 mm处；三阴交（SP6）位于后肢内侧，内踝尖 proximal 约10 mm处。所有动物及治疗过程中均应统一采用相同的定位依据、体位、进针角度和进针深度。

5. 样本采集

1. 在最后一次电针治疗后，对大鼠禁食24小时。
2. 在组织采集前，通过腹腔注射2%戊巴比妥钠（2 mL/kg）诱导深度麻醉。通过检查足底回缩反射消失及无自发运动来确认深度麻醉状态。
3. 在深度麻醉下，按照机构批准的方案对大鼠实施断头处死。
4. 立即无菌暴露生殖器官。分离一侧附睾尾用于精子分析，并切除一侧睾丸用于组织学检查。
5. 将睾丸置于4%多聚甲醛中固定至少24小时，然后进行组织学处理。

6. 精子分析

1. 去除附睾尾部周围的脂肪组织，并立即将组织放入 2 mL 预热至 37 °C 的生理盐水中。
2. 将组织在 37 °C 水浴中孵育 5 分钟，用眼科剪剪碎，经 200 目筛网过滤，并轻轻混匀滤液。
3. 取 10 µL 精子悬液加入预热的计数板中，使用计算机辅助精液分析系统（CASA）检测精子浓度和活力。
4. 同一批实验中的所有样品应使用相同类型的计数板、温育条件和采集参数。

7. 睾丸组织的组织学检查

1. 将睾丸组织置于4%多聚甲醛中固定，时间不少于24小时。修剪目标区域，并将其放入标记好的包埋盒中。
2. 依次通过梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸透、包埋，并切成4 µm厚的切片。
3. 将切片漂浮于40 °C水浴中展平，然后捞至载玻片上，并在60 °C烘箱中烘干。
4. 进行苏木精-伊红染色时，先用二甲苯脱蜡，再经梯度乙醇水化，随后用苏木精染色5–10分钟，伊红染色1–5分钟，最后脱水、透明并封片。
5. 在所有组别中，采用一致的放大倍数观察曲细精管的结构及生精细胞的排列情况。

8. 模型建立及治疗相关变化的评估

1. 通过与对照组相比，精子数量和活力下降，以及生精小管结构紊乱，来确认模型建立成功。
2. 通过电针治疗组相较于模型组精子数量和活力增加，以及生精小管形态部分恢复，来确认治疗相关变化。
3. 预先将技术操作受损的样本（如精子处理延迟、计数板加样失败或与造模无关的切片质量差等）定义为排除标准。在分析过程中记录任何被排除的样本。

结果

精子分析（图3）
使用计算机辅助精子分析系统对附睾精子悬液进行分析，以定量精子数量和活力。在此代表性数据集中，与对照组相比，腺嘌呤给药显著降低了这两项参数，证实模型构建成功。与模型组相比，电针（EA）干预随后提高了精子数量和活力（图3）。单因素方差分析显示，精子数量（F = 78.39，P < 0.001）和精子活力（F = 374.81，P < 0.001）的组间差异具有统计学意义。经Bonferroni校正的事后比较显示，对照组与模型组之间、以及模型组与EA组之间均存在显著差异。

睾丸组织学（图4）
图4展示了大鼠睾丸的代表性HE染色切片，各组均提供逐步放大的图像，包括250 µm的整体视图和100 µm的代表性生精小管区域插图。对照组显示出完整的睾丸组织结构，生精小管排列正常，生精细胞有序分布。相比之下，模型组的生精小管壁变薄，...

讨论

鉴于少弱精症的多因素病因以及现有药物治疗疗效有限，针灸和电针（EA）作为一种可重复的非药物干预手段日益受到关注¹⁹。现有的临床和临床前文献提示，针灸或电针可能通过多种合理机制影响男性生殖功能，包括调节神经内分泌功能、改善生殖器官微循环，以及减轻损害生精功能的氧化应激和炎症反应²⁰。这些提出的机制为在动物实验中开展对照研究、以精液参数和睾丸组织学作为主要观察指标来评估电针的作用提供了转化医学依据。

电针（EA）特别适用于以方案为导向的临床前研究，因为其刺激参数（如频率、强度、刺激时长和电极配对）可以被明确设定并比手工针刺操作更一致地重复²¹。在大鼠中，已有报道表明，在明确的实验条件下，通过参数控制的电针可促进损伤后生精功能的恢复，并在精液相关指标上观察到改善。近期的临床研究继续评估电针对男性不育的疗效，例如精子活力和总活动精子数，这反映了持续存在的转化研究兴趣，同时也强调了在临床前研究中建立明确定义且可重复操作流程的必要性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺嘌呤	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	A8330
CASA计算机辅助精液分析系统	中国台湾南宁松景天伦生物科技有限公司	VICOS-SPERM
离心	赛多利斯	A-14C
分化液	上海碧云天生物技术有限公司	C0163M
一次性无菌针灸针	Hanyi 品牌		0.25 mm ´ 13 mm
干燥机	徕卡	HI1220
电刺激器	常州盈迪电子医疗设备有限公司	KWD-808I
电子天平	杭州优衡称重设备有限公司	HLD-6002
伊红Y染色液	Lanke Biotech	BS248
苏木精染色液	珠海贝索生物技术有限公司	BA-4041
异氟烷	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
切片机	Leica	RM2255
中性树胶	北京中杉金桥生物技术有限公司	Zli-9555
石蜡包埋机	Leica	HistoCore Arcadia H
SD大鼠	宁夏医科大学动物中心		8周龄，雄性，180-220 g
切片扫描仪	徕卡	Aperio LV1
小型动物麻醉机	RWD生命科学有限公司	R500
涡旋振荡器	海门麒麟贝尔仪器制造有限公司	QL-902
加热垫	东莞宏达电子有限公司	45W-80X28CM