推拿对原发性失眠大鼠模型下丘脑食欲素-A表达及睡眠行为的影响

摘要

本研究通过行为学实验、免疫组织化学和实时定量PCR，探讨推拿是否通过调节下丘脑食欲素A的表达来缓解大鼠模型的失眠症状。

摘要

失眠是一种常见的睡眠障碍，可导致日间功能受损以及共病风险增加，显著影响患者的生活质量。目前的治疗方法主要包括认知行为疗法和药物治疗，但存在药物依赖、耐受性及停药后反跳等局限性。推拿疗法已被证实能够调节神经系统、内分泌系统和免疫系统，而食欲素系统是调控睡眠-觉醒周期的关键通路。这促使人们探索推拿是否通过调节下丘脑食欲素系统缓解失眠。本方案描述了在采用改良多平台水环境法建立的原发性失眠大鼠模型中实施推拿干预的方法。将64只Wistar大鼠随机分为四组：对照组、模型组、推拿组和食欲素拮抗剂组。进行行为学评估（旷场实验、戊巴比妥钠诱导睡眠实验），并检测下丘脑中Orexin-A的表达水平 通过 实时定量PCR和免疫组织化学。该方案旨在评估推拿的疗效，并探讨其与食欲素系统相关的潜在作用机制，为推拿在睡眠障碍中的应用及机制研究提供参考。

引言

失眠症以睡眠时长或质量不满意并导致日间功能受损为特征，是一种全球普遍存在的健康问题，给个体和医疗系统带来重大负担^1,2。在中国，失眠症的患病率尤为高，进一步加剧了其公共卫生影响³。该疾病与认知功能受损、心血管疾病风险增加以及抑郁症和焦虑症等精神疾病的高度共病密切相关^4,5。目前临床管理主要依赖认知行为疗法和药物治疗，尤其是苯二氮䓬类药物和非苯二氮䓬类镇静催眠药。然而，由于药物依赖性、耐受性、残留的日间效应以及戒断症状等问题，这些药物的长期使用受到限制，凸显了对有效非药物替代疗法的需求⁶。在临床实践中，推拿特别适用于寻求非药物干预的慢性原发性失眠患者，尤其适合药物依赖风险较高的老年人，以及孕妇或哺乳期妇女⁷。

推拿作为中医外治法的基石，在治疗失眠方面已显示出独特优势⁸。荟萃分析证据表明，推拿在总有效率（OR = 4.12）、睡眠质量以及焦虑抑郁状态方面显著优于药物或单纯针灸治疗，且安全性高⁹。特定推拿方案具有各自优势：传统推拿对痰热型失眠的有效率达89.5%，腹部摩法可将复发率降低至14.7%（vs. 常规推拿的38.2%）¹⁰。三部推拿法可使中药治疗疗效从80.49%提升至92.68%，同时改善睡眠结构和神经递质水平¹¹。临床研究和系统评价已证实，推拿可显著改善睡眠质量，降低焦虑和抑郁评分，并调节血清中5-羟色胺（5-HT）等神经递质的水平¹²。其治疗作用被认为通过整体调节神经-内分泌-免疫网络而实现。近年来，研究 increasingly 关注食欲素系统（orexin system），该系统是一种源自下丘脑外侧区的关键神经肽系统，在促进和维持觉醒中起重要作用¹³。食欲素神经元的异常过度激活参与了失眠的病理生理过程，而抑制该通路已显示出治疗潜力¹⁴。初步证据表明，如腹部摩法等手法可影响睡眠剥夺大鼠脑内Orexin-A的水平¹²，但目前尚缺乏关于推拿是否通过特异性调节食欲素系统发挥抗失眠作用的系统性研究。

因此，基于原发性失眠的大鼠模型，本研究旨在：（1）通过行为学实验评估标准化推拿干预对睡眠行为的改善作用；以及（2）通过检测推拿是否与下丘脑中Orexin-A表达下调相关，探讨其作用机制，并将其疗效与Orexin受体拮抗剂进行比较。本研究力图为推拿治疗失眠的中枢机制提供实验依据。

方案

所有实验操作和动物福利评估均经新疆医科大学动物伦理委员会批准（伦理批准编号：IACUC-20020158）。本方案遵循机构制定的实验动物护理与使用指南。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 动物准备

1. 饲养64只SPF级Wistar大鼠（体重250 g） ± 50 g，性别分布均衡）置于18–22℃的SPF屏障系统中 °C，12小时光照-黑暗循环。提供食物和水 随意.
2. 经过1周的适应性饲养后，将大鼠随机分为4组（每组n = 16）：对照组（A组）、模型组（B组）、推拿组（C组）和拮抗剂组（D组）。

2. 原发性失眠模型的建立

注意：除A组外，B、C和D组大鼠均需进行以下造模操作。

1. 准备一个塑料圆柱形容器（上口直径：30 cm，高：40 cm）作为大鼠饲养盒。
2. 将一个圆柱形平台（直径：6 cm，高：10 cm）固定在容器底部。
3. 向容器中加水，使水位低于平台表面1 cm。维持水温为20 °C。
4. 在容器内距平台15 cm高处水平放置一个圆形铁丝网（直径：25 cm，网孔大小：1 cm），并用细铁丝将铁丝网固定在容器边缘。
5. 将饮用水和食物放置在铁丝网上。每日更换饮水，并对容器进行清洁和消毒。
6. 每只容器放置一只大鼠于平台上，连续放置8天。

3. 采用戊巴比妥钠协同睡眠试验评估模型

1. 通过直接加入超纯水配制戊巴比妥钠溶液。称取1.0 g粉末，加入灭菌超纯水至100 mL，溶解后经0.22 µm滤膜过滤，得到1%（10 mg/mL）的溶液。
2. 第9天，对所有大鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液，剂量为诱导睡眠的最低阈值剂量（由预实验确定）。
3. 记录睡眠潜伏期（从注射到首次失去翻正反射的时间）和睡眠持续时间（从失去到恢复翻正反射的时间）。将翻正反射消失持续1分钟定义为睡眠开始，恢复翻正反射定义为睡眠结束。

4. 推拿干预

注意：干预在成功建模评估后的次日开始，每日进行一次，连续14天。A组和B组每日在固定架中束缚10分钟。操作人员在实验前需接受严格培训，以确保施力、频率和节奏的一致性。

1. 对于C组，将大鼠仰卧位固定于手术台上。
2. 用左手五指轻轻固定大鼠的四肢，充分暴露腹部。
3. 用右手进行腹部推拿：以中指末节指腹着力于关元穴（CV4，位于脐下25 mm处），其余四指自然伸直。
4. 以肩关节带动中指，用小幅度前外侧环形运动，在腹部进行逆时针环形移行摩擦。
5. 沿由鸠尾（CV15，剑突下5 mm）、关元（CV4）和双侧带脉点（GB26，第12肋游离端与髂前上棘连线中点）构成的闭合环形路径进行操作^th 肋骨和髂嵴上缘。
6. 以每分钟5–7个周期的速度进行平稳、持续、连贯的环形运动。
7. 先进行5分钟逆时针揉法，然后进行5分钟顺时针揉法。
8. 确保力度平稳有力，使大鼠保持安静且不挣扎。每日干预一次，持续14天。

5. 拮抗剂给药

1. 对于D组，以10 mg/kg的剂量每日一次经口灌胃给予MK-4305，连续给药14天。将MK-4305溶于生理盐水中，配制成5 mL溶液。

6. 旷场实验

1. 干预结束后，使用一个黑色立方体箱（底面：100 cm × 100 cm，高：40 cm）进行旷场实验。用灰色线条将箱底均分为25个方格（周边16个，中央9个）。
2. 将大鼠置于中央方格内，并开始计时。
3. 使用图像采集系统记录3分钟内大鼠的总移动距离、直立次数以及在中央区域停留的时间。
4. 每次实验后，清除粪便，并用75%乙醇擦拭清洁箱底和内壁。
5. 图像采集系统操作
   1. 设置图像采集系统。在旷场正上方1.5 m处垂直安装一台数字CCD相机（分辨率：1280 × 720像素；帧率：25 fps），并通过USB接口将相机连接至计算机。
   2. 配置追踪软件及分析参数。使用行为视频分析软件进行自动追踪，设置追踪参数如下：
      1. 将追踪焦点定义为大鼠的中心点（质心）。
      2. 图像采集与分析的帧率均设为25 fps。
      3. 校准空间分辨率，根据旷场尺寸和视频分辨率，使每个像素对应实际距离1.5 mm。
      4. 将背景差分阈值设为15个灰度级（范围：0–255），以区分大鼠与背景。
      5. 将最小事件持续时间设为0.2 s（5帧），以减少由噪声引起的假阳性检测。
      6. 将旷场虚拟划分为5 × 5个等面积方格（区域1–25）。将区域7、8、9、12、13、14、17、18、19定义为中央区域（中央3 × 3方格，占总面积的36%），其余方格定义为周边区域。
   3. 记录以下输出参数：总移动距离（mm）、平均速度（mm/s）、静止时间（s）、运动时间（s）、在各区域停留的时间（s）、在各区域移动的距离（mm）、进入各区域的次数以及直立次数。直立次数需人工核验。

7. 免疫组织化学灌注

注意：每组取 4 只大鼠用于免疫组织化学检测。

1. 准备0.9%生理盐水（预热至37 °C）和4%多聚甲醛溶液（4 °C保存）。
2. 采用腹腔注射乌拉坦（25%溶液，0.6 mL/100 g体重）深度麻醉大鼠，确认足底反射、角膜反射及翻正反射消失。
3. 将大鼠仰卧位固定于泡沫板上，迅速剪开皮肤、筋膜和胸骨以暴露胸腔。
4. 轻轻牵拉心脏以暴露主动脉，将针头自左心室心尖插入主动脉，直至针尖进入主动脉管腔；确保针头、左心室与主动脉呈水平对齐。
5. 用止血钳夹闭主动脉与针头，立即剪开右心房以利血液流出。
6. 用150–200 mL预热的0.9%生理盐水（37 °C）进行灌流；灌流成功的标志为肝脏、肠系膜和前肢变白，且右心房流出液澄清。
7. 更换为冷的4%多聚甲醛溶液（4 °C），灌流400 mL；初始阶段快速灌流，直至全身肌肉出现肌束震颤及肢体僵直，随后降低流速至2滴/秒，直至全部固定液灌注完毕。
8. 当脑组织呈现苍白且质地坚实时，表明固定成功。

8. 脑组织解剖

1. 灌注后，将大鼠断头，并小心地从颅骨中取出整个脑组织。
2. 使用剪刀沿矢状缝切开颅骨，用咬骨钳剥离顶骨和枕骨。
3. 用解剖铲轻轻抬起脑组织，用精细剪刀切断颅神经和视神经。
4. 用于免疫组织化学：立即把整个脑组织放入4%多聚甲醛中，在4 °C下后固定24小时。
5. 用于实时定量PCR：用预冷的生理盐水冲洗脑组织表面，滤纸吸干后，在液氮中冷冻5–10分钟，储存于–80 °C。所有操作步骤均需在冰上进行。

9. 免疫组织化学染色

1. 将下丘脑组织包埋于石蜡中，切取4–5 μm厚的冠状切片 µm 厚度切片。将切片贴附于防脱载玻片上，65℃烘烤 °C，持续1.5–2小时。
2. 在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中脱蜡（各10分钟）。梯度乙醇复水：无水乙醇Ⅰ和Ⅱ（各5分钟），然后依次为95%、90%、80%、70%乙醇（各5分钟），最后蒸馏水（5分钟）。
3. 将切片置于沸水中煮沸的0.01 M柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中进行抗原修复，放入压力锅中加热至压力阀升起后关闭热源，浸泡10分钟，随后自然冷却至室温。
4. 通过将切片浸入新鲜的3% H₂O₂中以灭活内源性过氧化物酶₂O₂ 室温下孵育10分钟。洗涤3次× 用PBS（每次5分钟）洗涤。
5. 用免疫组化笔圈出组织。加入兔抗HCRT/Orexin-A多克隆抗体（稀释比例1:50，约50 µL 每片）。4℃ 过夜孵育 °在加湿盒中。
6. 第二天，在室温下复温20分钟，洗涤3次× 用PBS洗涤（每次5分钟）。
7. 加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育20分钟，洗涤3次× 用 PBS 洗涤（每次 3 分钟）。
8. 加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，室温孵育20分钟，洗涤3次× 用 PBS 洗涤（每次 5 分钟）。
9. 制备DAB显色液（0.85 mL蒸馏水 + 50 µ每种试剂 A、B、C 各加 1 滴。将试剂加入切片，室温孵育 3–10 分钟，并在显微镜下观察显色情况。用自来水浸泡 3 分钟以终止反应。
10. 用苏木精复染3分钟。在1%盐酸酒精中分化1–2秒。自来水返蓝5分钟。
11. 用蒸馏水（3 分钟）、70%、80%、90%、95% 乙醇（各 3 分钟）以及无水乙醇 I 和 II（各 5 分钟）进行脱水。在二甲苯 I 和 II 中透明（各 5 分钟）。
12. 用中性树胶封片，37℃过夜干燥 °C.
13. 使用光学显微镜（40）观察并拍摄切片×, 100×, 200×, 400×使用 ImageJ 计数 Orexin-A 阳性细胞（胞质中呈棕色颗粒状沉淀）。
14. 将染色强度评分（0 = 无着色，1 = 浅黄色，2 = 浅棕色，3 = 深棕色）与阳性细胞百分比评分（0 = 0%，1 = 1–25%，2 = 26–50%，3 = 51–75%，4 = 76–100%）相乘，计算总分（0–12）。总分1–5定义为低表达，6–12定义为高表达。

10. Orexin-A mRNA 的实时定量 PCR

1. 组织解冻后的 RNA 处理必须在无 RNase 的条件下进行。具体的无 RNase 要求如下：
   1. 工作环境：使用经 RNase 去污剂擦拭并经过紫外线照射的专用 RNA 操作区域。
   2. 耗材：使用经认证的无 RNase 离心管和移液器吸头，或将其浸泡于 0.1% DEPC 水中后进行高压灭菌。
   3. 试剂：使用无 RNase 的裂解缓冲液和 DEPC 处理水。
   4. 操作：全程佩戴无粉手套，频繁更换手套，避免直接接触耗材内部及样品。
   5. 实验步骤
      注意：在 RNA 提取和反转录步骤中，所有接触 RNA 或反转录试剂的耗材和工具必须无 RNase。在 PCR 扩增阶段，由于 cDNA 为双链结构，RNase 无法降解双链 DNA，因此该阶段的耗材和工具仅需无 DNase 及可能抑制 PCR 反应的其他杂质；无需额外进行无 RNase 处理。在液氮中研磨冷冻的下丘脑组织。称取 50–100 mg 组织粉末放入含有 1 mL Trizol 的离心管中，混匀后室温静置 15 分钟。
2. 加入 200 µL 氯仿，颠倒混匀，室温静置 5 分钟。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
3. 将上层水相转移至新离心管中。加入等体积异丙醇，混匀后于 –20 °C 静置 35 分钟。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。弃去上清液。
4. 用 75% 乙醇洗涤沉淀，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。弃去上清液，并重复洗涤一次。
5. 室温下空气干燥沉淀，用无 RNase 水溶解。
6. 测定 RNA 浓度和纯度（A260/A280 比值为 1.8–2.1）。通过 1% 琼脂糖凝胶电泳评估完整性（清晰的 28S 和 18S 条带，5S 条带微弱或无）。
7. 配制反转录反应体系（20 µL）：800 ng 总 RNA，1 µL 随机引物（0.1 µg/µL），10 µL 2× TS 反应混合液，1 µL TransScript RT/RI 酶混合液，1 µL gDNA 去除剂，加无 RNase 水至终体积。
8. 在 25 °C 孵育 10 分钟，然后在 85 °C 孵育 5 秒以合成第一链 cDNA。用无 RNase 水将 cDNA 按 1:1 比例稀释。
9. 配制 qPCR 反应体系（10 µL）：5 µL EvaGreen 2× qPCR 主混合液，0.3 µL 正向引物（10 µM），0.3 µL 反向引物（10 µM），1 µL cDNA 模板，加无 RNase 水至终体积。每个样本设三个复孔。
   注意：引物序列：Orexin-A-F: 5’-CGCCAGAAGACGTGTTCCT-3’；Orexin-A-R: 5’-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3’（产物长度 88 bp）；β-Actin-F: 5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’
   β-Actin-R: 5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’（产物长度 150 bp）。
10. 运行 qPCR 程序：95 °C 预变性 30 秒；40 个循环：95 °C 变性 5 秒，60 °C 退火/延伸 30 秒。
11. 验证扩增曲线和熔解曲线。取 5 µL 扩增产物进行 2% 琼脂糖凝胶电泳，确认扩增特异性。
12. 采用 2^⁻ΔΔCt 法计算 Orexin-A mRNA 的相对表达量，以 β-Actin 作为内参对照。

11. 统计分析

1. 使用 SPSS 26.0 进行数据分析。所有数据均以均值 ± 标准差表示。若数据符合正态分布，两组间比较采用独立样本 t 检验；否则采用 Mann-Whitney U 检验。
2. 多组间比较时，若方差齐性，采用单因素方差分析（ANOVA）并结合 LSD 事后检验；若方差不齐，则采用 Tamhane’s 检验。若数据不符合正态分布，采用 Kruskal-Wallis H 检验。以 P < 0.05 为差异具有统计学意义。

结果

表1显示，与A组相比，B、C、D组在造模后睡眠潜伏期显著延长，睡眠持续时间显著缩短，表明原发性失眠大鼠模型成功建立。 表2与表3的结果初步支持推拿在治疗失眠方面的治疗作用。 开放旷场实验（OFT）是行为神经科学中评估啮齿类动物焦虑样行为最经典且最常用的范式之一¹⁵。研究表明，对四个角落区域的偏好是衡量焦虑样行为的敏感指标，且在中低程度焦虑下可能比中心区域指标更具区分性。失眠模型大鼠表现出明显的焦虑样行为及探索行为的改变^16,17，而推拿干预有效缓解了这些大鼠的焦虑样行为。 表4、表5以及图1所示的分子生物学结果进一步表明，推拿可有效下调失眠模型大鼠下丘脑中Orexin-A的过度表达。

图 1：各组大鼠下丘脑中Orexin-A的免疫组织化学染色结果（40×, 100×, 200×, 400×）。（A）在大鼠下丘脑组织中可见Orexin-A阳性神经元，呈深棕色颗粒状信号。染色强度评分为3分，阳性细胞百分比为40%（位于26%–50%范围内，评分为2分），总评分为6分，属于高表达范围。（B）与正常组相比，大鼠下丘脑组织中Orexin-A阳性神经元数量显著增加，阳性细胞分布更密集。染色强度评分为3分（深棕色），阳性细胞百分比达80%（位于76%–100%范围内，评分为4分），总评分为12分，属于高表达范围。（C）与模型组相比，大鼠下丘脑组织中Orexin-A阳性神经元数量减少。染色强度评分为3分（深棕色），阳性细胞百分比为75%（位于51%–75%范围内，评分为3分），总评分为9分，属于高表达范围。（D）与模型组相比，大鼠下丘脑组织中Orexin-A阳性神经元数量也减少。染色强度评分为3分（深棕色），阳性细胞百分比为60%（位于51%–75%范围内，评分为3分），总评分为9分，属于高表达范围。 请点击此处查看该图的高清版本。

组别	睡眠潜伏期 / min	睡眠持续时间 / min
A	4.13 ± 1.80	49.75 ± 38.46
B	6.31 ± 2.80*	22.13 ± 11.41*
C	6.33 ± 2.60*	24.93 ± 14.43*
D	6.53 ± 1.90*	24.73 ± 17.59*

表1：造模后各组戊巴比妥钠诱导睡眠试验的比较。* 表示与对照组相比，P < 0.05。

组别	直立次数	静止时间（秒）	运动时间（秒）	运动距离（米）	中心区域停留时间（秒）	中心区域运动距离（米）	角落区域停留时间（秒）	角落区域运动距离（米）	侧边区域停留时间（秒）	侧边区域运动距离（米）
A	1.875 ± 0.835	76.700 ± 34.324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8.750 ± 7.718	2.937 ± 5.112	103.000 ± 28.582	6.315 ± 3.893	56.600 ± 27.772	6.705 ± 3.666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3.244 ± 2.991	75.088 ± 21.561	6.578 ± 1.972	85.463 ± 23.374	11.724 ± 4.959
T值	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
P值	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

表2：对照组（A）与模型组（B）各指标水平影响分析.* 表示 P < 0.05 与对照组相比。

组别	筑巢频率	静止时间（秒）	运动时间（秒）	运动距离（米）	中心区域停留时间（秒）	中心区域运动距离（米）	角落区域停留时间（秒）	角落区域运动距离（米）	侧边区域停留时间（秒）	侧边区域运动距离（米）
B	5.875 ± 2.295	29.819 ± 12.871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13.992	5.823 ± 1.422	83.019 ± 15.464	9.878 ± 4.393
C	6.357 ± 0.627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23.291 ± 4.873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68.943 ± 9.240	10.420 ± 1.225
D	6.667 ± 1.633	30.808 ± 15.389	149.200 ± 15.380	18.584 ± 4.969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74.600 ± 22.248	5.744 ± 1.291▲	74.192 ± 17.011	9.465 ± 3.380

表3：模型组（B）、推拿组（C）和拮抗剂组（D）中各指标水平影响的分析。^△P< 0.05，与模型组（B）比较；^▲P< 0.05，与推拿组（C）比较。

组别	食欲素-A
A	1.011 ± 0.173
B	10.436 ± 2.512△
C	2.392 ± 0.998▲
D	3.227 ± 1.703▲

表4：下丘脑组织中食欲素-A mRNA的表达水平。^△P < 0.05，与对照组（A）比较；^▲P < 0.05，与模型组（B）比较。

组别	Orexin-A
	染色强度	阳性细胞百分比	百分比评分	评分
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

表5：各组大鼠下丘脑中Orexin-A的免疫组织化学染色评分。染色强度评分标准：0 = 无着色（阴性，无色），1 = 浅黄色，2 = 浅棕色，3 = 深棕色。阳性细胞百分比评分标准：0 = 0%，1 = 1%–25%，2 = 26%–50%，3 = 51%–75%，4 = 76%–100%。总分 = 染色强度评分 × 阳性细胞百分比评分。总分1–5定义为低表达，总分6–12定义为高表达。

讨论

本研究旨在评估推拿疗法在原发性失眠大鼠模型中的疗效，并探讨其与下丘脑食欲素系统相关的潜在作用机制。研究结果表明，标准化的推拿干预显著改善了睡眠潜伏期和睡眠持续时间，缓解了类焦虑行为，并有效下调了下丘脑中食欲素A在mRNA和蛋白质水平的过度表达。值得注意的是，推拿的效应与食欲素受体拮抗剂MK-4305相当，提示调节食欲素系统可能是推拿缓解失眠的关键机制之一。

与药物干预相比，推拿作为一种非侵入性外治法，在安全性、不良反应少以及患者依从性方面具有优势^12,18。临床证据支持推拿对失眠的治疗作用，显示其可改善睡眠质量和心理状态^18,19。其作用机制是多方面的，涉及下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节、自主神经系统稳态的维持，以及5-HT等关键神经递质的调控^18,20。本研究结果进一步拓展了这一认识，明确指出食欲素系统是推拿作用的一个特异性靶点。食欲素神经元是维持觉醒的核心驱动因素，其过度兴奋与睡眠不稳定相关^21,22,23。推拿后观察到食欲素A的表达下调，这一效应与新型失眠药物——双食欲素受体拮抗剂的作用相似，提示药物与非药物干预手段可能通过共同的通路发挥作用^24,25。

尽管本研究基于我们先前发表的关于腹部推拿和食欲素-A调节的研究²⁵，但当前论文在原始报告的基础上进行了显著拓展和方法学上的优化。具体而言，本研究将样本量扩大至64只大鼠，以提高统计效能，并引入了一系列全面的行为学评估方法，包括旷场实验和戊巴比妥诱导睡眠实验，系统评价睡眠结构及类焦虑行为，而这些内容在先前的研究中并未涉及。与之前重点研究氧化应激和经典神经递质的工作不同，本文通过整合行为学结果与分子检测手段，优先对食欲素系统的功能进行验证，作为一项独立的机制性研究，补充而非重复​此前的研究发现。

实验设计遵循中医理论，聚焦于腹部及特定穴位（如关元穴（CV 4）），该穴位被认为具有补益元气、调节内脏功能的作用，并在闭环操作路径内进行^26,27。参数（频率、持续时间、疗程）根据前期研究进行了标准化，以确保实验的一致性和可重复性，这对于机制性动物研究至关重要¹²。

然而，本方案存在一些局限性。首先，推拿干预仅在造模后单一时间点进行。未来的研究应探讨不同的干预持续时间和频率，以建立推拿的最佳“剂量-效应”关系。其次，本研究为观察性研究设计。尽管发现了推拿与嗜睡素A（Orexin-A）表达降低及行为改善之间的相关性，但仍不清楚该关联是推拿的直接或间接作用，还是其他因素所致。未来研究可采用基因敲除、化学遗传学抑制或拮抗剂阻断等实验策略，进一步验证推拿是否通过调控嗜睡素A的表达来改善失眠行为，从而阐明其因果机制。最后，本研究未设立假手术或安慰剂干预对照组。然而，在实验设计阶段已对此有所考虑，所有动物组均接受了相同程度的抓握和固定操作，这在一定程度上控制了非特异性应激因素的影响。此外，本研究中推拿方案的频率、强度和操作路径均基于预实验进行了标准化，以确保干预的一致性和可重复性。未来的研究应致力于开发更严格的对照方法，例如采用非接触模拟或最小触觉刺激，以明确推拿操作的具体效应。

本方案成功的关键步骤包括： 首先，在改良多平台水环境法中严格控制水温及平台尺寸；其次，实验前对亚阈剂量的戊巴比妥钠进行滴定；第三，标准化推拿操作参数（频率为5–7次/分钟，先逆时针操作5分钟，再顺时针操作5分钟）并进行操作者培训；第四，将下丘脑组织迅速在液氮中冷冻，随后在无RNase条件下操作，以确保Orexin-A mRNA的稳定性。

可能的改进包括： 首先，开发一种自动化的机械推拿装置，以减少操作者之间的差异；其次，采用脑电图（EEG）/肌电图（EMG）遥测技术替代戊巴比妥钠睡眠实验，实现对睡眠阶段的连续监测；第三，结合化学遗传学或光遗传学方法，验证食欲素神经元在介导推拿效应中的必要性。

本方案的可重复性基于以下几点： 详细的操作路径与参数、阳性对照药物的使用、在蛋白和mRNA水平上的双维度检测，以及严谨的统计学报告。其 实际可用性 体现在以下几个方面：行为学测试对设备要求较低，无需昂贵的遥测系统；建模实验周期仅为8天，推拿干预周期为14天，总时长不超过4周，与大多数常规科研项目的经费周期和实验室安排高度契合，有利于快速完成数据采集与方法学验证。此外，推拿操作方案在操作路径（CV15 → CV4 → 双侧GB26 → 返回CV15）、频率（5–7次/分钟）、方向顺序（先逆时针后顺时针）和持续时间（每次10分钟）等方面均实现了明确的量化。这些具体规范使得不同操作者经过短期培训即可掌握该技术，从而降低因个体差异导致的手法操作研究中常见的可重复性差的风险。

在实施本方案过程中，可能会出现若干常见问题，建议采取相应的故障排除措施。首先，在改良多平台水环境实验过程中，大鼠可能会从平台上掉落 ，这通常是由于平台表面过于光滑所致。解决方法是使用细砂纸轻轻打磨平台表面，以增加摩擦力。此外，每个容器应仅饲养一只大鼠，以避免相互干扰。第二，戊巴比妥钠睡眠实验可能无法显示组间显著差异。 解决方法是在预实验中使用另一批动物（每组3–4只），以5 mg/kg为增量重新测定最小亚阈剂量。注射应每天在同一时间进行（建议在上午9:00至11:00之间），以尽量减少昼夜节律变异。第三，大鼠在接受推拿操作时可能出现挣扎或发声现象， 这通常提示施力过大或固定不当。操作者应减小施加的力量，直至大鼠保持安静且无挣扎反应。建议在操作前使用压力感应模型进行培训，以标准化施力程度。大鼠应仰卧位放置，四肢轻柔但牢固地固定，确保腹部完全暴露。第四，同一实验组内Orexin-A阳性细胞百分比出现较大变异， 通常源于下丘脑切片层面不一致、计数时的主观偏差或染色批次间的差异。推荐的解决方案是参照大鼠脑图谱（如Paxinos & Watson），通过定位前囟后1.8 mm至3.3 mm的冠状切片，标准化解剖水平用于下丘脑分析。细胞计数应由两名不知分组信息的独立观察者完成，并取平均值。针对同一检测指标的所有样本应在同一批次中染色，建议使用ImageJ进行半自动阈值分析，以降低观察者主观性。

综上所述，本研究在原发性失眠模型中建立了一套标准化的推拿干预方案及多层次评价体系。研究提供了有力证据，表明推拿可改善失眠行为，其潜在机制可能与抑制下丘脑Orexin-A的过度表达有关。该方法学框架不仅为探讨推拿中枢作用机制提供了可重复的研究范式，也为其他非药物干预睡眠障碍的机制研究提供了参考依据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5x 一体化反转录预混液	abm	G492	cDNA 合成
乙酰胆碱（Ach）	南京建成	A105-1	ELISA 试剂
粘附性载玻片	江苏世泰实验器材有限公司	N/A	组织切片贴附
琼脂糖	生工生物（上海）	A811BA0014	凝胶电泳
无水乙醇	天津富宇精细化工有限公司	N/A	组织脱水
抗体稀释液	北京中杉金桥生物技术有限公司	ZLI-9029	一抗稀释
染色架	福州迈新生物技术开发有限公司	N/A	载玻片支架
柠檬酸盐粉末	福州迈新生物技术开发有限公司	MVS-0066	抗原修复缓冲液配制
盖玻片	江苏世泰实验器材有限公司	N/A	显微镜观察
DAB 显色试剂盒	福州迈新生物技术开发有限公司	DAB-1031	显色检测
DEPC	生工生物（上海）	B417BA0001	去RNase处理
多巴胺（DA）	武汉华美生物工程有限公司	CSB-E08660r	ELISA 试剂
电泳槽	北京六一仪器厂	DYCZ-21	凝胶电泳
电泳电源	北京六一仪器厂	DYY-6C	凝胶电泳
EvaGreen Express 2× qPCR 预混液-低 Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	qPCR 试剂
γ-氨基丁酸（γ-GABA）	AMOKE	AE91068Ra	神经递质 ELISA 试剂
凝胶成像系统	上海天能	2500	凝胶图像记录
H2O2（30%）	天津富宇精细化工有限公司	N/A	内源性过氧化物酶封闭
苏木精染色液	福州迈新生物技术开发有限公司	CTS-1097	复染
高速冷冻离心机	上海离心机械研究所	Nefuqe 15R	样品离心
组胺（HIS）	南京建成生物工程研究所	EH171-1	ELISA 试剂
电热鼓风干燥箱	上海精宏实验设备有限公司	DHG 系列	样品干燥
免疫组化染色湿盒	福州迈新生物技术开发有限公司	BOX-1001	湿式孵育盒
免疫组化染色试剂盒	北京中杉金桥生物技术有限公司	SP9000	免疫组化染色
恒温培养箱	上海精宏实验设备有限公司	DNP-9272	温控孵育
电磁炉	广东美的生活电器制造有限公司	C21-RK2101	加热源
酶标仪	Bio-Rad，中国	xMark	吸光度测定
显微镜	Nikon	E200	显微成像
MK-4305	美仑生物	MB3773	实验试剂
中性树胶	北京中杉金桥生物技术有限公司	ZLI-9555	封片介质
去甲肾上腺素（NA）	南京建成	H096	ELISA 试剂
核酸蛋白定量仪	北京凯奥科技有限公司	K5500	核酸定量
食欲素 A（Orexin A）	武汉华美生物工程有限公司	CSB-E08860r	ELISA 试剂
PCR 扩增仪	Bio-Rad，美国	MyCycler Thermal Cycler	PCR 扩增
磷酸盐缓冲液（PBS）	福州迈新生物技术开发有限公司	PBS-0060/0061	洗涤缓冲液
移液器	Eppendorf，德国	Dragon lab	液体操作
高压锅	浙江苏泊尔股份有限公司	YW20F1	抗原修复
蛋白质定量试剂盒	全式金生物	DQ111-01	BCA 蛋白检测试剂盒
兔抗-HCRT（食欲素-A）多克隆抗体	生工生物（上海）	D163595	一抗
实时荧光定量 PCR 仪	ABI（Thermo Fisher）	QuantStudio 6 Flex	qPCR 分析
冰箱	合肥美菱股份有限公司	BCD-249LCK	样品储存
5-羟色胺（5-HT）	武汉华美生物工程有限公司	CSB-E08364r	ELISA 试剂
染色缸	通用	N/A	玻片染色容器
免疫组化超级画圈笔	福州迈新生物技术开发有限公司	PEN-0002	疏水屏障笔
Trans2K DNA Marker	全式金生物	BM101	DNA Marker
TRIzol 试剂	Ambion	15596026	RNA 提取
涡旋混合器	海门市麒麟-贝尔实验室仪器有限公司	GL-88B	实验室混匀器
二甲苯	天津富宇精细化工有限公司	N/A	脱蜡