通过可控萌发与比较培养法分离番茄种子相关微生物群

摘要

本实验方案结合标准化的种子表面灭菌与可控萌发，旨在实现番茄种子相关微生物群在种子到幼苗转变过程中的可重复分离。该方法提高了在干燥种子中代表性不足的可培养微生物的回收率，并支持在幼苗早期发育阶段进行比较性培养组学研究。

摘要

表面灭菌是在分离种子相关微生物的研究中至关重要的步骤，但常常未得到充分优化。过于剧烈的处理可能会减少或扭曲内生微生物群落。本实验方案提供了一种可重复的方法，通过基于已验证方法的表面灭菌条件并结合受控的种子萌发过程，用于分离可培养的番茄种子相关微生物群。该方法并不试图定义适用于所有情况的最佳灭菌条件，而是采用可标准化的处理流程，可根据种子特性进行调整，同时最大限度地减少偏差并保护内生微生物群落。

为了提高与种子到幼苗转变过程相关的可培养微生物的回收率，本方案在微生物分离之前引入了一个受控的萌发步骤。与基于研磨干燥未萌发种子的传统方法不同，受控萌发可在无菌条件下促进种子向幼苗转变期间微生物的活化。对等量生物重复样本进行基于菌落形成单位（CFU）的比较分析，每个样本由3–5粒干燥种子或3–5株萌发后幼苗的混合材料组成，结果显示萌发后可培养微生物群落发生了显著变化。在干燥种子中丰度较低的属在萌发后得到富集，而另一些在干燥种子中较丰富的分类群其相对丰度则下降，该结果支持了关于幼苗建立过程中早期植物-微生物相互作用的研究。

在生物学重复中，Stutzerimonas、Stenotrophomonas 和 Priestia 等属在萌发幼苗中分离获得的菌株中持续富集，而 Paenibacillus 在不同条件下均保持较高丰度，但在物种水平上的组成表现出显著变化。本方案通过结合标准化的表面消毒条件、受控的种子萌发过程，以及对干燥种子与萌发后材料的比较分析，为分离与种子相关的微生物群落提供了一个稳健且可重复的培养组学框架，有助于研究这些微生物在早期幼苗发育中的潜在功能作用，并支持对幼苗建立过程中早期植物–微生物相互作用的深入探索。

引言

种子含有多种与内部组织和外部表面相关的细菌和真菌微生物群落^1,2,3。这些微生物正日益被视为植物生物学的重要组成部分，因为它们能够从植物最早期的发育阶段开始影响其生长表现，包括种子萌发、幼苗定植以及对生物和非生物胁迫的响应^1,2,3。从生态学角度来看，种子不仅作为植物繁殖的繁殖体，同时也作为微生物接种源的储存库，因此成为理解植物相关微生物组在整个植物生命周期中如何建立和维持的关键切入点^1,2,3。

与种子相关的微生物可能是萌发植物接触到的第一批微生物接种源，因此在种子到幼苗的转变过程中有助于微生物组的组装^1,3,4。这一早期接种源可能影响后续定殖于根部及其他植物组织中的微生物群落，进而影响植物的定植以及后期的植物-微生物互作^1,4。此外，部分种子微生物群可通过花、胚珠和花粉等生殖结构进行垂直传播，使微生物种群得以在不同植物世代间持续存在^4,5。这种跨代连续性表明，某些种子携带的微生物可能持续促进植物适应性与适合度。

从功能上看，种子相关微生物可通过多种机制影响宿主植物的性能，包括产生植物激素、抗菌化合物以及其他能够调节植物发育或抑制竞争者和病原体的生物活性代谢物^5,6,7。通过差异性资源利用和生态位分化，种子传播的微生物群落似乎能够共存，这表明种子代表了一种具有选择性的生境，而非微生物多样性的被动容器⁷。综合来看，这些研究结果支持以下观点：种子中定殖的微生物群落可能影响植物的早期发育，并可作为后续功能表征的候选对象^2,3,5,7。

为了以功能明确且实验上可操作的方式研究种子相关微生物，必须从种子材料中分离出具有活性的微生物群体。在此背景下，微生物分离能够获得可存活的微生物，以便后续通过实验进行表征，并在与植物-微生物互作相关的下游实验中进行评估。这一点在种子体系中尤为重要，因为种子相关的微生物可能参与植物早期定植过程，并可作为功能筛选及未来应用开发的候选菌株。

种子相关微生物的回收对样品制备过程高度敏感，尤其是表面灭菌、组织处理以及取材材料的发育阶段。这种敏感性在种子体系中尤为显著，因为微生物生物量通常较低，微小的操作差异都可能显著影响菌落形成单位数量及分离物的组成。在这些变量中，表面灭菌是最关键且最难优化的步骤之一。灭菌的目的是在微生物分离前减少表生污染，但灭菌剂暴露过度会降低内生微生物的存活率或可培养性，而灭菌不足则可能导致与表面相关的类群在后续培养中占主导地位^8,9,10。因此，灭菌的目的并非最大化化学试剂的暴露强度，而是采用最温和的处理方式，有效抑制来源于表面的污染，同时最大限度保留可回收的内部微生物^5,11。

由于灭菌效率取决于植物种类、组织结构、种皮特性以及相关的微生物群落，因此应从已有验证的方法中选择合适的方案，并谨慎地针对所研究的体系进行优化调整^8,12,13。在番茄种子等低生物量材料中，这种平衡尤为重要：过度灭菌可能显著降低微生物的回收率，而灭菌不足则会增加快速生长的表面污染物在所获分离物中占主导地位的可能性。因此，应常规验证灭菌效果，而不应默认其有效。对最终漂洗液进行涂布培养可作为残留外部污染的实用对照，但该对照结果必须结合种子或幼苗匀浆液中的微生物回收情况共同解读。若某一方案虽能获得无菌的漂洗液对照，但几乎无法回收内部微生物群，则在以比较性微生物分离为目标（而非最大程度去污染）的研究中可能并不适用^6,8,10,14。

因此，有意义的比较需要严格的程序标准化。在低生物量样本中，洗涤、转移、均质化、稀释、涂布或培养条件的不一致，均可能影响微生物的总回收量以及各个分类群的表观丰度。这一点在比较干燥材料与萌发后材料时尤为重要，因为方法学上的差异很容易被误认为是生物学上的变化。

许多种子微生物学实验方案的一个主要局限在于，它们完全依赖干燥的、未萌发的种子作为起始材料。尽管这为种子激活前存在的微生物组分提供了有用的基线数据，但可能会低估那些处于休眠状态、代谢不活跃、受到胁迫或初始相对丰度较低的微生物^2,15。

在干燥状态下，种子处于一种生理上静止的环境，其中宿主组织和相关的微生物可能都保持相对不活跃的状态。因此，直接从干燥种子中分离出的微生物群落可能并不能完全代表种子萌发开始后更容易被分离出的微生物群落。

在萌发过程中，种子会经历吸水、代谢重激活、营养物质动员以及组织重组，这些过程均会改变与之相关的微生物可利用的局部环境^11,16。这些变化可促进微生物生长，改变微生物种群的相对丰度，并有助于检测或分离此前在干燥种子中稀有或难以回收的分类群。此外，胚根的突破形成了新的植物区室，可能支持微生物的增殖与重新分布，因此种子到幼苗的转变阶段是微生物学分析中尤为有价值的一个时期^1,17。

因此，同时处理干燥种子和萌发幼苗比仅分析干燥种子能提供更具信息量的实验设计。干燥种子可建立激活前可培养微生物种群的基线，而萌发后的材料则可用于比较评估在早期发育过程中更易被分离到的分类群。当研究目的不仅在于记录可分离的微生物，还希望鉴定与种子到幼苗转变相关的分类群，并优先选择用于后续特征分析的分离株时，该方法尤为有用（图1）。

图1：比较性分离流程的概念与操作总览。（A）种子萌发前干燥番茄种子状态的概念示意图。（B）种子从萌发到幼苗转变阶段的番茄种子状态的概念示意图。（C）本实验方案的流程图，包括种子表面灭菌、冲洗对照评估、干燥种子的直接处理或受控萌发、合并生物学重复样本后的均质化处理、梯度稀释与涂板、基于CFU的定量分析、分离株回收、分类学鉴定，以及干燥与萌发材料的比较分析。流程中突出的关键控制点包括灭菌效率、生物学重复的一致性，以及涂板和CFU分析的可重复性。图A和图B为借助人工智能生成的概念性插图，仅用于视觉展示。请点击此处查看该图的高清版本。

由于该实验方案旨在比较从干燥材料和萌发材料中回收的微生物，因此严格的方法学一致性至关重要。所有比较均应使用同一批种子、相同的灭菌条件、相同的培养基，以及等效的稀释、涂布和培养程序进行。若缺乏这种程度的标准化，干燥样本与萌发样本之间的表观差异可能反映的是技术性变异，而非具有生物学意义的富集差异。这一点在分离工作流程中尤为重要，因为所回收的微生物组分既受到生物样本本身的影响，也受到实验操作过程选择性效应的影响^4,15。

生物学重复同样不可或缺。低丰度类群在不同种子批次之间可能存在差异，即使在严格控制的条件下，从低生物量样本中回收微生物本身也具有内在的随机性。为了进行可靠的比较，建议每种条件至少设置五个独立的生物学重复。在此工作流程中，每个生物学重复由3至5粒干燥种子或3至5株萌发幼苗的混合材料组成，并作为单个样本进行处理。此外，所有在灭菌后的操作均应在无菌条件下进行，以最大限度地减少二次污染，并确保所获得的分离物集合具有可解释性。

萌发时间的选择也应谨慎。时间必须足够长，以允许胚根伸出和幼苗早期发育，但又不能过长，以免后期植株生长引入与种子到幼苗直接转变无关的额外生态复杂性。对于番茄，在无菌条件下最长5天的萌发期提供了一个实用的时间窗口，此时幼苗仍与种子环境密切相关，而早期微生物的活化和重新分布已经可以发生。实验间保持一致的时间点至关重要，因为发育阶段的差异本身可能影响微生物回收模式。当研究目标是在标准化条件下评估与萌发相关的微生物变化时，该实验流程最适合用于从低生物量种子系统中进行可培养微生物群的比较性回收。该方法不太适用于对种子微生物组总多样性进行直接估计，或需要采用非培养依赖性方法来捕获更广泛微生物群落的实验体系。

本实验方案的目的是通过结合标准化的表面灭菌与受控的种子萌发，提供一种可重复的框架，用于分离可培养的番茄种子相关微生物群。该方法能够使用等量的生物学重复样本，对干燥种子和萌发幼苗进行比较分析；每个重复样本均由3–5粒干燥种子或3–5株萌发幼苗的混合材料组成，以评估菌落形成单位（CFU）回收量及分类学组成在萌发依赖性变化中的差异。通过减少灭菌偏差并在种子向幼苗转变过程中促进微生物的回收，该方法有助于分离在早期幼苗发育过程中可能具有功能意义的微生物，并支持对早期植物–微生物相互作用的后续研究。

方案

1. 试剂、培养基和无菌材料的准备

1. 使用无菌蒸馏水配制70% (v:v) 的乙醇溶液。
2. 将含5%有效次氯酸钠的商品次氯酸钠溶液稀释，取20 mL次氯酸钠溶液加入80 mL无菌蒸馏水中，配制成20% (v:v) 的工作液。
3. 准备用于洗涤步骤的无菌蒸馏水。
4. 准备无菌0.45% NaCl溶液，用于样品均质化和连续稀释，并在整个实验流程中保持使用同一批次溶液。
5. 配制Luria Bertani (LB) 琼脂培养基（每升：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl和15 g琼脂），并在无菌条件下提前倒平板。
6. 对所有在种子或幼苗灭菌后会与其接触的器械（包括镊子、研钵、涂布棒、剪刀和试管架）进行灭菌处理，采用高压灭菌或经过验证的无菌方法。
7. 在开始处理种子前，将无菌培养皿、试管、移液器吸头和培养平板放置于超净工作台内。
   注意：由于与种子相关的微生物生物量可能较低，因此应尽量减少不必要的操作时间，并在开始灭菌前准备好所有材料。化学处理、洗涤、涂板或萌发设置之间的延迟可能会引入恢复率的变异性。在其他实验体系中可使用替代的无菌缓冲液，但在任何特定的比较实验中应始终使用同一种缓冲液。在扩展的培养组学工作流程中，可加入其他培养基（如Reasoner's 2A (R2A) 或选择性培养基），但本研究所描述的比较性实验方案以LB琼脂作为标准培养基。

2. 种子的选择与分配

1. 每次实验应尽可能使用同一批次的番茄种子。
   注意：在本示例工作流程中，每个实验均全程使用同一批次的‘Money Maker’品种番茄种子。
2. 目视检查种子，剔除受损、明显破裂或畸形的种子。
3. 将种子分配至研究所需的各个实验组。至少应将种子分为以下两组：灭菌后直接用于干种子取样，以及萌发后用于幼苗取样。
4. 若需测试多种灭菌条件，应将种子随机分配至不同的灭菌处理组，以避免因种子大小或状态差异而引入处理偏差。
   注意：所有后续比较均应基于平行处理的同一批种子，以增强结果的可靠性。该工作流程可适用于其他番茄基因型或品种，但实验内的任何比较均应使用同一批次且平行处理的种子进行。

3. 番茄种子的表面灭菌

1. 在超净工作台内，将3–5粒种子转移至每个无菌的2 mL微量离心管中。
2. 向每根管中加入1 mL 70% (v:v) 乙醇，确保种子完全浸没。
3. 将管子置于25 rpm转速的管式旋转仪上，轻柔混匀，孵育5分钟。
4. 使用无菌移液器彻底移除乙醇。
5. 立即向每根管中加入1 mL 20% (v:v) 次氯酸钠工作液，确保种子完全浸没。
6. 将管子置于25 rpm转速的管式旋转仪上，轻柔振荡，孵育10分钟。
7. 使用无菌移液器彻底移除次氯酸钠溶液。
8. 用1 mL无菌蒸馏水洗涤种子三次，每次洗涤使用1 mL水。
   1. 每次洗涤时，加入无菌水，轻柔混匀30秒，必要时让种子沉降30秒，然后彻底移除洗涤液，再加入新鲜的无菌水。
9. 保留每根管中的最后一次漂洗水，用于灭菌效率的对照检测。
10. 根据种子是作为干种子立即处理，还是用于控制萌发，将灭菌后的种子转移至无菌培养皿或无菌离心管中。
    警告：操作次氯酸钠时应佩戴适当的个人防护装备，并严格遵守机构规定的化学品安全操作规程。
    备注：此处采用的乙醇-次氯酸钠序列是基于先前验证的灭菌流程，作为番茄种子的标准工作条件。在比较实验中，所有样品应使用相同的灭菌条件。若评估多种灭菌方案，应平行处理各组，并独立评估每种条件下的灭菌效率。应尽量缩短最终漂洗与后续操作之间的时间，以减少微生物回收的变异性。

4. 灭菌效率的验证

1. 用无菌0.45% NaCl对最终冲洗水进行10倍系列稀释：将100 µL冲洗水转移至900 µL稀释液中，依次连续操作至10^-4。采用与干燥种子和萌发幼苗匀浆相同的方法，将每种稀释液各100 µL涂布于LB琼脂平板上。
2. 将平板在28 °C条件下培养24–48小时。
3. 培养后观察平板上的菌落生长情况。
4. 记录每个稀释度下菌落的有无。若发现菌落，需记录稀释倍数、大致菌落数量以及可见的菌落形态。
   注意：整个实验过程中应使用相同的涂布体积和涂布方式，以便于冲洗对照组与生物样本之间的直接比较。若在未稀释或最低稀释度的冲洗对照平板中未检测到菌落，则记录该样本在所用培养条件下无可见生长。

5. 干燥（未萌发）种子的处理

1. 将3–5粒已灭菌的干燥种子（对应一个生物学重复）转移至含有1 mL无菌0.45% NaCl溶液的无菌2 mL微量离心管中。
2. 使用无菌一次性研磨杵充分研磨种子，直至种子组织明显破碎，无完整种子结构残留。
3. 将匀浆液涡旋振荡30秒，使微生物细胞均匀重悬。
4. 用无菌0.45% NaCl溶液对匀浆液进行10倍系列稀释：取100 µL匀浆液加入900 µL稀释液中进行第一次稀释，并按相同比例依次连续稀释至10^-6。
5. 采用涂布法将选定稀释度的100 µL样品接种于LB琼脂平板上。
6. 将平板置于28 °C培养24–72小时。
7. 选择产生孤立且可计数菌落的稀释度对应的平板，用于后续菌落形成单位（CFU）估算及分离株回收。
8. 记录总菌落数、可见的菌落形态类型以及各重复间生长模式的任何差异。
   注意：干燥种子的处理应与萌发幼苗样品平行进行，使用相同的培养基、稀释方案、接种体积和培养条件。本比较工作流程中采用LB琼脂作为标准培养基。当需要更广泛地回收生长缓慢的分类群时，可在扩展的分离工作流程中加入其他培养基。

6. 无菌条件下灭菌种子的萌发

1. 将灭菌后的种子放置在无菌的萌发支持物上，例如MS（Murashige和Skoog）琼脂平板。
2. 均匀分布种子，避免幼苗萌发后相互接触。
3. 用实验室封口膜或具有类似功能的材料密封平板，以减少外部污染，同时允许正常萌发。
4. 将平板水平置于25 °C黑暗条件下培养。
5. 在无菌条件下培养种子，直至初生胚根的形成清晰可见；在代表性实验中，这相当于培养5天。
6. 定期检查平板，观察是否存在污染、萌发异常或过多冷凝水。
   注意：各重复组之间的萌发条件应保持一致。萌发时间或幼苗发育阶段的差异可能独立于所研究的效应，影响微生物的回收率。其他无菌萌发支持物（如植物琼脂平板或无菌湿润滤纸）也可用于调整后的实验流程，但每个实验内所用支持物必须保持一致。根据萌发容器的不同，可采用不同的平板放置方向进行培养，但同一实验中放置方向应保持一致。（暂停点）如有必要，萌发后的幼苗可在处理前短暂保存于4 °C，但应尽可能立即进行后续处理。

7. 从萌发的幼苗中分离微生物

1. 在超净工作台内使用无菌镊子收集已萌发的幼苗。
2. 将来自3–5株萌发幼苗的混合材料（对应一个生物学重复）转移至无菌的2 mL微量离心管中。
3. 向每根试管中加入1 mL无菌的0.45% NaCl溶液。
4. 使用无菌一次性研磨杵充分匀浆混合的幼苗材料，确保包含初生根及相关的残留种子组织，直至组织明显破碎。
5. 将匀浆液涡旋振荡30秒，以均匀释放并重悬微生物细胞。
6. 用无菌0.45% NaCl溶液对匀浆液进行10倍系列稀释：取100 µL匀浆液加入900 µL稀释液中进行第一次稀释，并按相同比例依次连续稀释至10^-4。
7. 采用分区涂布法，将选定稀释度的100 µL样品接种至LB琼脂平板上。
8. 将平板在28 °C条件下培养24–72小时。记录总菌落数、可见的菌落形态类型以及与干种子样品的差异。
   注意：将一个生物学重复定义为来自3–5株萌发幼苗的混合材料，所有重复应采用相同的稀释方案、接种体积、培养基和培养条件平行处理。匀浆时应包含残留种子组织和初生根，以确保萌发幼苗样品间的一致性。

8. 菌落计数与分离物回收

1. 孵育结束后，选择产生可计数且分离良好的菌落的稀释平板。用于菌落形成单位（CFU）估算的平板应包含30–300个菌落。
2. 计数所选平板上的菌落数，并使用以下公式计算每个生物学重复的CFU：
   ​每个重复的CFU =（菌落数 × 稀释倍数）/ 接种体积（毫升）
   1. 若同一稀释度使用了多个平板，应先计算该稀释度下菌落数的平均值，再代入公式进行计算。
3. 使用标准化描述符记录菌落形态，包括大小、形状、颜色、边缘、隆起度和透明度。
4. 为尽量减少取样偏差，选择用于后续分离的菌落。当菌落数量较少时，应选择所有可区分的形态类型；当菌落数量较多时，应在多个平板上随机选取多个菌落。
5. 将选定的菌落重新划线接种至新鲜的LB琼脂平板上，以获得纯培养物。
6. 重复划线操作，直至每个分离株在平板上表现出一致的菌落形态。
   注意：应明确说明CFU值是以每个生物学重复、单位生物量还是其他归一化方式表示。若采用了额外的归一化方法（如基于生物量的归一化），需在数据分析部分明确描述其计算方法。

9. 纯化分离物的保存

1. 将纯菌落接种至液体LB培养基中，培养至出现可见生长。
2. 按照标准微生物学操作，将培养物与无菌80%甘油按1:1（v:v）比例混合。
3. 将甘油菌保存于-80 °C。
4. 为每个分离株建立数字记录，包括样品来源、重复编号、状态（干种子或萌发幼苗）、灭菌处理、分离日期、平板培养基、菌落形态及后续鉴定状态。
   注意：若需将富集模式追溯至种子阶段、处理方式或生物学重复，准确的分离株元数据至关重要。

10. 分离株的分子鉴定

1. 根据制造商说明书，使用细菌DNA提取试剂盒从纯化的细菌培养物中提取基因组DNA。
2. 扩增细菌的16S rRNA基因，可选择其V5-V8高变区或接近全长的16S rRNA基因。
   1. 扩增V5–V8区（约700 bp）时，使用引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1392R（5′- ACGGGCGGTGTGTRC-3′）。
   2. 扩增接近全长的16S rRNA基因（约1500 bp）时，使用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。
   3. 每项聚合酶链式反应（PCR）体系总体积为25 µL，包含PCR预混液、每种引物0.4 µM以及1 µL模板DNA。
   4. 在PCR仪中运行以下程序：95 °C预变性2 min；随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性3 s、45 °C退火30 s、72 °C延伸2 min；最后72 °C终延伸7 min。每次PCR运行均需设置无模板阴性对照。
3. 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用凝胶成像系统观察扩增片段。
4. 根据制造商说明书，使用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，并将纯化后的扩增子送交进行Sanger测序。
5. 对获得的序列进行质量检查、修剪和必要时的拼接。
   1. 使用BLASTn（针对高度相似序列采用Megablast参数）将每条序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI）核苷酸数据库进行比对。
   2. 根据支持度最高的比对结果确定分类学归属。当最佳比对结果具有足够的比对覆盖度且序列相似性至少达到94.5%时，可将分离株归类至属水平。
   3. 仅当最佳比对结果的序列相似性至少达到98.7%、查询序列覆盖度高，且在近缘物种中无冲突的顶级匹配时，方可进行临时性的种水平分类。
   4. 若多次扩增失败或测序质量不足，则将该分离株记录为“未鉴定”。由于仅凭16S rRNA基因序列相似性可能无法区分近缘细菌种，因此所有种水平的分类均应视为初步结果，并在需要时通过系统发育分析或基于基因组的方法加以确认。
6. 以可支持的最高分类分辨率报告分离株的身份。利用这些鉴定结果验证基于形态学的分组，并优先选择代表性分离株用于后续的基因组和功能分析。
   注意：本分子鉴定步骤旨在支持分离株的分类及代表性菌株的筛选，不应用于推断群落结构或不同处理间定量丰度模式。

11. 数据分析

1. 每种条件下至少进行五次生物学重复实验。
   ​注意：在此工作流程中，每个生物学重复由3–5粒干燥种子或3–5株萌发幼苗的混合材料组成，并作为单个样品进行处理。
2. 针对每种条件，定量分析以下指标：(i) 总CFU回收量，(ii) 可见菌落形态类型的数量，(iii) 纯化分离株的数量，以及 (iv) 回收的可培养微生物群在属水平上的分类组成，如适用，还包括种水平。
3. 比较干燥种子与萌发幼苗样品，以评估萌发依赖性的总回收量及分类组成的改变。
4. 将每个分类单元的相对丰度计算为在各条件下总回收CFU的百分比。使用绝对CFU值计算倍数变化。
5. 使用适当的统计分析软件（例如 GraphPad Prism [v11.0.2]）分析定量数据。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。
   1. 对于干燥种子与萌发幼苗样品之间的两两比较，若数据符合正态性假设，则采用双尾Student t检验。
   2. 若不符合上述假设，则采用Mann–Whitney U检验。当p < 0.05时，认为差异具有统计学显著性。
6. 应明确说明所展示的每个数值对应的是绝对CFU、基于CFU计算的相对百分比，还是由绝对CFU值计算得出的倍数变化。
   注意：在整个研究中使用相同的计算标准，以便直接比较干燥种子与萌发幼苗样品。在展示分类组成时，应明确指出数值是在属水平还是种水平上呈现的。

12. 关键质量控制点与故障排除

1. 仅通过无菌终洗步骤本身并不能证明所选的灭菌方案对实验目标而言是最优的。应在尽量减少外部污染的同时，确保能够回收种子内部或与种子紧密结合的可培养微生物。需结合干种子和萌发幼苗匀浆中的微生物回收结果，共同解读冲洗对照的结果。
2. 若干种子和萌发样品中的微生物回收率均较低，可能表明灭菌过度、匀浆条件过于剧烈、培养条件不适宜或样品处理延迟。在此情况下，应核实灭菌时间是否一致，确认组织破碎程度充分但不过度，并确保所有样品的稀释、涂布和培养操作均立即进行且条件相同。
3. 若冲洗对照中污染严重，或少数几种菌落类型迅速过度生长，可能表明灭菌不充分，或在灭菌后操作过程中引入了污染。此时应重新检查灭菌时间、洗涤步骤、无菌操作技术，以及超净工作台内物品的摆放布局，再重复实验。
4. 只有当萌发阶段、生物学重复设计、培养基、稀释方案、涂布体积及培养条件在整个实验中保持标准化时，方可对干种子与萌发样品之间的差异进行生物学意义上的解读。
5. 在处理生物量较低的种子材料时，某一条件下特定分类群的表观缺失，也可能源于取样不足而非真实缺失。因此，应进行一致的重复处理，并在分离株水平上进行鉴定，以可靠地解析与萌发相关的微生物群落变化。

13. 保存样本以用于其他方法

1. 在验证灭菌效率后、涂板前，将每份干燥种子或萌发幼苗匀浆液额外转移200 µL至无菌的1.5 mL微量离心管中。
2. 在每根离心管上标注样品类型、生物学重复编号、处理条件及采集日期。
3. 立即冷冻这些分装样品，并在-80 °C下保存，直至用于后续分析。
4. 使用储存的匀浆材料进行互补性分析，例如基于DNA的分析、基于显微镜的检测，或需要相同起始生物学重复的验证实验。
   注意：应在梯度稀释和涂板前保存分装样品，以保持原始匀浆液的组成。若计划进行多项后续分析，应制备独立的分装样品，避免反复冻融循环。

结果

表面灭菌效果及外部污染的控制
采用基于先前已验证方法的标准化条件进行表面灭菌，可有效减少外部微生物污染，同时保持从种子来源材料中可培养微生物的回收率。最终冲洗水的平板培养未检测到菌落生长，表明在所用条件下，与表面相关的微生物已被有效去除。

重要的是，冲洗对照中未检测到微生物生长，但这并未伴随干种子或萌发幼苗匀浆中可回收微生物的减少。这表明所采用的灭菌条件有效降低了外部污染，同时并未影响后续从处理过的种子材料中回收可培养微生物。综上所述，这些结果表明该实验方案在灭菌效率与下游微生物回收之间实现了预期的平衡。

干燥种子中可培养微生物群落的回收率有限且组成受限
对灭菌后的干燥未萌发种子进行处理后，在生物学重复中 consistently 获得的可培养微生物数量均较低。菌落形成单位（CFU）计数普遍偏低，且培养平板通常仅由少数几种形态型主导，表明在此条件下仅有种子相关微生物群落的一小部分可被有效回收。

讨论

本文展示的结果表明，将标准化的表面灭菌与受控的种子萌发相结合，为种子相关微生物组的培养组学分离提供了一个可靠的框架。该方案的一个关键成果是能够在有效去除外部污染物的同时，保留内生微生物群落。这种平衡在基于培养的研究中至关重要，因为过于严格的灭菌会降低微生物的回收率，而灭菌不足则可能因表生微生物的增殖而引入偏差^6,16。本方案并未定义适用于所有情况的最佳灭菌条件，而是采用了一种基于先前已验证方法的策略，可根据种子特性及实验目标进行调整⁶。这些结果表明，本研究中采用的标准化条件在最大限度减少外部污染的同时，保持了可培养微生物的回收率。

种子是植物相关微生物群进入的关键门户，作为微生物的储存库，能够在植物生长的最早期阶段影响其发育，并在植物生命周期中参与微生物组的构建^1,2,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	01916-500G	LB 琼脂培养基的组分；用量为 15 g/L。
高压灭菌器	Lab1st	SV120H	用于器械/材料的灭菌或验证无菌处理效果。
细菌DNA提取试剂盒	Promocell	PK-MB708-206-100	DNA提取
菌落计数/记录装置	OCS	B079Y5W57N	用于记录菌落形成单位（CFUs）、形态类型及平板差异；文中未指定具体计数器型号。
冷冻保存管	Sigma-Aldrich	Z359033	用于甘油菌种在 -80 °C 条件下的保存；虽未明确提及，但保存步骤中必需。
数字菌株记录系统	文中未指定	不适用	用于记录菌株的元数据：来源、重复编号、条件、灭菌处理、分离日期、培养基类型、形态特征、鉴定状态。
乙醇	VWR	83813440	用于配制 70% v/v 乙醇溶液，进行种子表面灭菌。
滤纸	Fisher Scientific	11718772	可选的萌发支持材料。
镊子	Sigma-Aldrich	930229	用于转移种子及收集已萌发的幼苗。
基因组DNA提取试剂盒	PromoCell	PK-MB708-206-100	用于从纯化后的细菌培养物中提取基因组DNA；具体试剂盒或方法未明确说明。
无菌80%甘油	VWR	24388364	与液体培养物按1:1 v/v比例混合，用于制备冷冻保存菌种。
层流洁净台 Bio48	Faster	LAB-CAP-22	用于无菌操作种子、灭菌转移及无菌材料的制备。
LB琼脂培养基	VWR	846495000	用于比较性培养的标准培养基；每升含胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、琼脂15 g。
微量离心管	Ratiolab	RATI5615000	用于种子灭菌及样品处理。
MS培养基	Sigma	M0404-10L	作为无菌萌发支持材料用于无菌萌发。
NZYTaq II 2× 预混液	Nzytech	MB35803	用于PCR扩增的预混液
封口膜	Parafilm/Merck	HS234526A	用于密封萌发平板，以减少污染。
培养皿	Labbox	PDIP-E9N-500	用于萌发装置、涂布及处理灭菌后的种子。
植物琼脂	Duchefa Biochemie	9002-18-0	作为可选的替代性无菌萌发支持材料被提及。
移液器套装及吸头	Merck	EP3123000918-1EA	用于移除灭菌溶液、洗涤、稀释及涂布。
R2A琼脂培养基	HI-MEDIA	M1743-500G	用于扩展培养组学流程的可选附加培养基。
氯化钠，NaCl	Fisher Chemical	10040460	用于配制无菌0.45% NaCl溶液，进行匀浆及系列稀释；也是LB培养基的组分之一。
次氯酸钠	Carlo Erba	370323	用于配制20% v/v次氯酸钠溶液进行种子表面灭菌。具有腐蚀性，需佩戴个人防护装备（PPE）。
无菌一次性研磨杵	Eppendorf	EP0030120973	用于干种子及萌发幼苗的匀浆处理。
涡旋振荡器	Fisher Scientific	15901137	用于重悬匀浆液中的微生物细胞。