简单且易于操作的卵孵化检测方法 秀丽隐杆线虫可变格式的药物筛选

摘要

本研究介绍了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中灵活且标准化的卵孵化检测平台，该平台整合了多种实验形式。该方法提高了实验的可重复性、可扩展性和可及性，能够有效评估药物效应和发育过程，同时具备成本低、易于适应科研应用和教学环境的优点。

摘要

卵孵化实验（EHA）被广泛用于评估化学化合物对线虫早期发育阶段的影响，尤其在驱虫药物研究中具有重要应用。然而，现有的方法在形式、复杂性和可重复性方面存在显著差异，且通常以固定实验方案的形式呈现，而非可灵活调整的实验框架。本研究通过整合并直接比较三种实验配置，建立了一种针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的简单、易操作且灵活的卵孵化实验平台：（i）在微量离心管中进行受控孵育，随后接种至琼脂平板；（ii）在含药物的琼脂平板上直接暴露处理；（iii）基于多孔板的液体实验体系。实验中采用两种代表性化合物以展示该方法的应用效果：一种可抑制卵的孵化，另一种则无明显可检测的作用。每种配置在实验控制性、通量和可及性方面均具有独特优势。基于微量离心管的方法可实现对药物暴露的精确控制，适用于定量药理学分析；基于琼脂的实验方法操作简便、成本低廉，适合持续暴露处理及教学环境；多孔板格式则支持可扩展、标准化的高通量筛选，符合现代药物发现流程的需求。通过对这些格式的直接比较，我们阐明了方法学选择如何影响实验的可重复性、药物暴露动力学以及生物学结果的解读，尤其涉及特定发育阶段的相关因素，例如卵壳的保护作用以及分子靶点表达在发育过程中的变异。总体而言，本研究确立了秀丽隐杆线虫（C. elegans）卵孵化实验作为一种多功能且可扩展的实验平台，可适应多种应用场景，包括驱虫药物筛选、毒理学评估、发育生物学研究以及教学实验，从而促进该方法更广泛且更合理的使用。

引言

卵孵化实验（EHA）长期以来一直是线虫学中评估化学化合物杀卵活性及早期发育影响的核心方法。该方法最初为寄生性线虫设计，用于在受控条件下定量分析胚胎发育或幼虫孵化的抑制情况 体外 条件，提供诸如孵化率或浓度-反应分析（如EC）等稳健且具有生物学意义的终点指标₅₀ 或 IC₅₀)^{1,2,3,4,5,6,7}.

在捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）和蛇形毛圆线虫（Trichostrongylus colubriformis）等寄生性线虫中，传统的基于虫卵的研究方法已被广泛用于评估合成药物和天然产物的驱虫效果，并监测抗驱虫药耐药性^1,2,6,8,9,10。这些方法涵盖多种检测指标，从直接评估虫卵活力和孵化率，到检测粪便培养后幼虫的发育情况。总体而言，这些方法在关联药物暴露与寄生虫繁殖能力及传播潜力方面发挥了核心作用。然而，这些方法通常需要从感染宿主中进行复杂的样本制备，较长的孵育周期，以及专业的实验设施，这可能限制其可及性、可扩展性以及实验室间的可重复性。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式生物的应用已成为克服寄生性线虫研究中多种局限性的有力策略。其生命周期短、遗传操作简便、易于培养，且与寄生性物种共享关键的分子靶点，因此特别适用于药理学、毒理学和发育学研究。重要的是，C. elegans 的胚胎发育迅速且高度可重复，使得卵存活率和孵化实验可作为早期发育过程及其受外源物质干扰情况的定量且可靠的检测指标^{11,12,13,14,15,16,17}。

此外，已有大量特征明确的突变菌株可供使用，这有助于深入理解药物作用及耐药的机制。先前的研究表明，对生物活性化合物的耐药性可能以发育阶段依赖的方式产生，胚胎期和幼虫期表现出不同的敏感性。例如，谷氨酸能信号通路的改变与幼虫耐药表型相关，而卵的孵化则不受影响^14,18,19,20。这凸显了药物敏感性的阶段特异性，提示胚胎期可能涉及与后期发育阶段不同的作用靶点或药物可及性的差异。

除了寄生虫学领域外，C. elegans 的卵存活率检测在毒理学和早期药物发现中也日益重要。这些检测不仅用于评估驱虫活性，还用于评价发育毒性以及药物诱导的胚胎缺陷，其结果可能与高等生物的毒性特征相关^15,16。与此同时，卵壳的存在引入了重要的生物学限制，因其作为包围胚胎的保护性且具有选择性通透性的屏障^21,22。因此，某些生物活性分子可能无法到达胚胎，即使其在后续发育阶段表现出活性^14,19,23,24。化合物进入胚胎的可能性因而可能取决于其各自的理化性质，包括分子大小和极性。这可能导致卵孵化检测中的活性结果与后续发育阶段的活性结果之间存在差异。这一区别凸显了明确定义实验条件以及所测量生物学终点的重要性。

从方法学上讲，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的卵孵化实验已采用多种实验形式，包括同步化卵的液体培养、直接暴露于含药物的琼脂平板，以及适用于中高通量筛选的多孔板实验^{11,13,14,16,19,23,24}。

基于液体和微孔板的方法已广泛应用于药理学筛选研究，因为它们能够提供均一的暴露条件，便于精确控制药物浓度，并可对浓度-反应关系进行定量分析。与此同时，针对寄生性线虫，类似的多孔板策略也得到了广泛发展，从传统的96孔板检测到采用384孔格式的超高通量平台均有涉及^4,5。这些方法共同凸显了卵孵化检测在不同线虫物种中的多功能性和可扩展性，以及其在从小规模机制研究到大规模化合物筛选等多种实验条件下的适应能力。

不同实验体系在实验控制性、可重复性、通量和可及性方面具有各自的优势与局限性。基于液体的检测方法可提供均一的暴露条件，适用于定量药理学分析；而基于琼脂的检测方法可在整个发育过程中实现持续暴露，但会因药物扩散和生物利用度问题引入变异性。多孔板格式则能够实现并行操作并减少试剂消耗，符合现代筛选策略的要求。

尽管广泛使用，卵孵化实验通常被描述为固定的操作流程，而非一种灵活的方法学框架。不同实验形式之间的直接比较十分有限，而在从机制研究到高通量筛选或教学环境等特定应用场景中，如何选择最合适实验配置的指导也仍然不足。

本研究提出了一种简单、易行且可灵活调整的平台，用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的卵孵化实验，整合并比较了三种实验方案：（i）在微量离心管中进行受控孵育，随后接种至琼脂平板；（ii）直接暴露于含药物的琼脂平板；（iii）基于多孔板的液体实验体系。

通过系统评估这些实验条件，我们旨在建立一个实用的框架，以阐明实验控制性、操作简便性和可扩展性之间的权衡关系。这种整合性视角将经典的寄生虫学方法与现代基于模型的筛选技术相结合，使虫卵孵化实验不再局限于一种单一的标准化技术，而是成为一个可适应多种研究场景的多功能平台，包括驱虫药物发现、毒理学评估、发育生物学研究以及教学应用。

方案

1. 秀丽隐杆线虫 品系与培养

1. 使用野生型 N2（Bristol）菌株和/或转基因菌株 PD4251（ccIs4251; dpy-20(e1282)）来建立并验证本方法^25,26。PD4251 表达 GFP，便于在需要时进行可视化观察和潜在的成像应用，且在本研究采用的实验条件下，其卵孵化和发育反应与野生型 N2 菌株无显著差异²⁷。
2. 从由美国国立卫生研究院研究基础设施项目资助的Caenorhabditis遗传中心（CGC）（P40 OD010440）获取菌株 （例如野生型 N2 菌株）。
3. 将线虫在标准实验室条件下，于 18–25 °C 的新鲜制备的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上培养，以大肠杆菌 OP50 作为食物来源。制备 NGM 时，将 16 g 琼脂、3 g NaCl 和 2.5 g 胰蛋白胨溶解于 975 mL 蒸馏水或超纯水中，高压灭菌。待培养基冷却至 55 °C 后，加入无菌的磷酸钾缓冲液（25 mL，1 M，pH 6.0）、CaCl₂（1 mL，1 M）、MgSO₄（1 mL，1 M）和胆固醇（1 mL，5 mg/mL，溶于无水乙醇）。充分混匀后，在无菌条件下倒平板。
4. 按照 WormBook 及相关研究中描述的标准操作程序进行常规操作、传代和维持^24,26,28,29。通过确保持续提供细菌食物并避免平板过度拥挤，维持线虫处于非饥饿状态。将培养物保持在推荐的温度范围（18–25 °C）内，并避免过于干燥的环境，以防琼脂过快脱水。
5. 开始实验前的一般注意事项
   1. 预先确定所有实验参数，包括温度（18–25 °C）、孵育时间（4–8 h）、湿度 （50–70%）以及操作流程。
   2. 在开始实验前准备好所有材料，以确保时间安排和工作流程的协调性。
   3. 在所有重复实验中保持一致的实验条件，以尽量减少变异性。

2. 测试化合物和对照品的制备

1. 实验当天新鲜配制所有化合物。根据化合物的相容性和检测条件，将储备液溶解于M9缓冲液（22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO₄）或无菌蒸馏水中^30,31。
   注意：水相介质的选择可能影响化合物在秀丽隐杆线虫（C. elegans）检测中的活性。例如，血清素等化合物在无菌蒸馏水与M9缓冲液中配制时，其有效浓度可能不同。因此，在优化检测方法时，应通过实验评估溶剂的相容性及生物响应。对于水溶性较低的化合物，可使用适当的溶剂，如二甲基亚砜（DMSO）或乙醇。最终溶剂浓度应保持较低水平（通常低于0.2% v/v），以避免产生毒性。既往在线虫（C. elegans）中的研究表明，在标准实验室条件下，DMSO浓度不超过0.5%时影响极小¹⁷。
2. 每种化合物至少配制五个浓度，以便构建浓度-反应曲线并估算IC₅₀或IC₉₀值。初始可采用2至3倍浓度梯度进行系列稀释，并根据各化合物的预期效价、溶解度和实验响应调整最终浓度范围。
   注意：若待测化合物对光敏感，所有配制步骤均应在弱光条件下进行，以防止降解。这包括储备液、稀释液以及含药琼脂平板的制备。尽可能用铝箔包裹平板并避光保存。同样，多孔板在孵育期间应保持加盖（例如使用铝箔或不透明盖子）。建议使用密闭容器或避光湿盒，以在整个实验过程中维持化合物的稳定性。
3. 每次实验均应包含以下对照：仅缓冲液对照（M9或水）和溶剂对照（例如，与处理组中相同浓度的DMSO或乙醇）。
   注意：溶剂的选择至关重要。DMSO和乙醇常被使用，因其可在低浓度下溶解疏水性化合物且具有生物相容性。也可考虑其他方法，如吐温20（Tween 20）或环糊精，以提高溶解度。药物溶液应在配制后立即使用，因其随时间的稳定性可能变化，进而影响实验的可重复性。

3. 获取同步化的 C. elegans 卵

注意：秀丽隐杆线虫（C. elegans）卵的分离已在先前的研究中被广泛描述^29,32。此处总结了主要步骤，并进行了少量修改，以优化获得干净、无碎片的卵，适用于卵孵化实验。

1. 收集 gravid 蛔虫
   1. 从 3–5 块含有大量成年 gravid 蛔虫的 NGM 平板开始^25,26。优先选择含有大量 gravid 蛔虫且可见卵的平板，以表明其处于活跃繁殖状态，同时避免使用过度拥挤或营养耗尽的培养物。此阶段通常不进行精确的蛔虫计数，因为 C. elegans 的卵分离方案通常依赖于密集繁殖的培养物，而非精确的个体数量。作为一般参考，每块 60 mm 的平板应含有数百只 gravid 成虫。
   2.  向每块平板中加入蒸馏水，并轻轻冲洗蛔虫至 15 mL 圆锥形离心管中。避免刮擦琼脂表面，以尽量减少杂质。
   3. 在 18–25 °C 条件下以 266 × g 离心 3 分钟，使蛔虫沉淀。弃去含有细菌的上清液。
   4. 弃去上清液，并重复洗涤步骤三次。每次均需轻柔重悬沉淀，以提高残留细菌的去除效率。
2. 通过漂白法分离卵
   1. 将蛔虫沉淀重悬于新配制的漂白液中（1.2% NaOCl 和 0.5 M NaOH；终体积 5 mL）。应在使用前立即配制，以确保其活性。
      注：正确漂白的样本定义为成虫尸体被破坏或消化，而完整卵在形态上正常且具有活力。过度漂白的样本表现为卵受损或裂解、卵形态异常、孵化率降低，或在培养后无存活幼虫²⁵。
   2. 剧烈振荡离心管，以促进成虫体溶解并释放卵。在孵育过程中持续混匀，以确保暴露均匀。
   3. 密切监测反应过程，时间不得超过 5 分钟。通过肉眼观察：成虫体应基本溶解，而卵保持完整。
   4. 密切监测反应过程，并在 5 分钟时加入冷的无菌蒸馏水（优选 10 °C）至终体积 14 mL 以终止反应。切勿超过此时间，以防损伤卵。
   5. 盖紧管盖并轻柔倒置数次，迅速稀释漂白液。此步骤应立即进行，以保持卵的活力。
   6. 在 18–25 °C 条件下以 266 × g 离心 3 分钟，小心弃去上清液。
   7. 用无菌蒸馏水洗涤卵沉淀三次，彻底去除残留漂白剂。每次洗涤之间确保充分重悬。将卵重悬于 5 mL M9 缓冲液或无菌水中。
      注：漂白 gravid 雌雄同体可获得无菌卵制剂，适用于同步化实验。在缺乏食物的情况下，孵化的幼虫将进入 L1 发育停滞期，并在喂食后同步恢复发育。
3. 纯化步骤（蔗糖漂浮法）
   1. 若在漂白后可见蛔虫残渣，则执行此步骤。
   2. 通过稀释 60% 无菌蔗糖储备液配制 30% 蔗糖溶液（例如，等体积混合：5 mL 60% 蔗糖与 5 mL 蒸馏水）。
   3. 将蔗糖溶液加入沉淀中，并通过倒置轻柔混匀。避免使用涡旋振荡器。
      注：由于该纯化步骤时间短暂，且随后立即进行洗涤以去除残留蔗糖，因此在本研究条件下未观察到对卵活力的可检测影响。相比之下，去除蛔虫残渣可显著改善卵的可视化效果、计数准确性，以及各样本间药物暴露的均一性。
   4. 在 18–25 °C 条件下以 266 × g 离心 5 分钟。
   5. 将卵层识别为溶液顶部的一圈薄白色环状物。立即用移液器小心沿该环移动枪头，收集含卵的上清液 4 mL。
   6. 此步骤应迅速完成，因为离心后卵会因重力作用而开始下沉。
   7. 将收集的上清液转移至含有无菌蒸馏水的洁净离心管中。用冷的无菌水洗涤卵两次，以去除残留蔗糖。
      注：此步骤为可选，但强烈推荐。去除残渣可改善卵的可视化和计数准确性，并防止卵被困在残留蛔虫物质中，从而确保对测试化合物的暴露更加均匀。
4. 卵储备液的制备
   1. 取样前轻柔混匀卵悬液，因为卵会快速沉降。
   2. 在载玻片上放置三滴 20 µL 液滴，在体视显微镜下计数卵。
   3. 计算平均值，并使用 M9 缓冲液将浓度调整为每 100 µL 含 50–100 个卵。分装前再次混匀，以维持均匀分布。
   4. 根据选定的实验方案，为每种实验条件分装所需体积的卵悬液。

4. 虫卵孵化实验方案

1. 微量离心管中的短期卵暴露（高控制性格式）
   注意：该实验配置基于先前描述的方法²⁵，并进行了改进以增强对暴露条件的控制和可重复性。
   1. 用于卵孵化实验的琼脂平板制备
      1. 仅使用琼脂和蒸馏水制备无药物琼脂平板（100 mL 水中加入 1.7 g 琼脂）。不要添加营养物质或细菌，因为本实验旨在评估无食物来源干扰下的卵孵化情况。每个 35 mm 培养皿中倒入约 3 mL 琼脂，以确保实验间琼脂厚度一致。
      2. 在使用前 12–24 小时制备平板。避免超过此时间范围，因为过度干燥会降低卵的存活率并影响幼虫运动。
      3. 琼脂凝固后将每个平板分为四个象限，以便计数。
      4. 将平板密封后储存在 8–10 °C 条件下以防止脱水。使用前让平板恢复至室温。
   2. 每种实验条件下，将 500 µL 卵悬浮液转移至 1.5 mL 微量离心管中。在移液过程中轻柔混匀，防止卵因重力快速沉降。维持均匀悬浮状态对于确保各条件间卵数量可比性至关重要。
   3. 向 500 µL 卵悬浮液中加入 500 µL 处理溶液或相应的对照溶液。在 22 °C 下孵育 4–8 小时。应预先确定孵育时间并在所有实验中保持一致（例如 6 小时），因为孵育时间的变化会直接影响药物暴露效果。
      注意：处理溶液应配制为所需终浓度的 2 倍，以便与卵悬浮液混合后稀释至目标工作浓度。
   4. 孵育期间使用管式旋转仪（例如 5–20 rpm 垂直旋转）或摇床平台持续进行轻柔振荡。确保离心管始终处于运动状态，以防止卵沉降并促进均匀暴露。此步骤至关重要，静态条件会导致卵聚集和药物暴露不均。
   5. 孵育结束后，在 18–25 °C 条件下以 3,420 × g 离心 3 分钟。识别沉淀物，其表现为管壁上的微小白点。离心前应统一标记管子方向（例如标记一侧），以便快速定位沉淀并防止在去除上清液时意外丢失。
   6. 小心去除上清液，避免扰动沉淀。用 M9 缓冲液洗涤卵三次以去除残留化合物。将最终沉淀重悬于 240 µL M9 缓冲液中。
   7. 将悬浮液分装到琼脂平板上，每个象限加 20 µL。每种条件使用三个平板。待液滴完全干燥后再移动或倒置平板，以防止卵在表面发生位移。
      注意：为补偿洗涤步骤中的卵损失并确保最终样品量足够用于铺板和计数，起始卵悬浮液总体积应略大于理论所需量。为简化操作并减少琼脂平板的使用（尤其适用于教学场景），可将重悬后的卵直接转移至多孔板而非琼脂平板。调整每孔终体积为 200 µL，并在未使用的孔中加入无菌水以减少蒸发。
2. 在含药琼脂平板上的直接卵暴露
   1. 制备仅含琼脂和无菌蒸馏水的琼脂溶液（100 mL 水中加入 1.7 g 琼脂）。加热至完全溶解并保持液态。待琼脂冷却至 50–55 °C 后再加入任何化合物，并使用实验室温度计监测温度。此步骤对保持化合物稳定性及实现均匀掺入至关重要，如先前所述²⁸。每种化合物至少准备五个浓度，以便进行浓度-反应分析和 IC₅₀ 估算。
      注意：不要添加细菌食物来源。在缺乏食物的情况下，孵化出的幼虫将进入同步化的 L1 发育停滞状态，从而在实验期间阻止其进入后续幼虫阶段^26,33。
   2. 向冷却后的琼脂中加入适量的药物溶液或溶剂对照。通过缓慢翻转轻柔混匀，确保分布均匀。避免涡旋或剧烈震荡，以防产生气泡。
   3. 立即向 35 mm 培养皿中倒入约 3 mL 琼脂。操作应稳定进行，以保持温度和板厚一致。每种条件至少制备 3–5 个平板。
   4. 平板的储存与处理如下：让平板在平坦表面上于室温下凝固。将平板倒置储存，以防止冷凝水接触琼脂表面。
   5. 设置实验：将 50–100 个卵直接接种到琼脂平板上。保持恒定的实验参数，包括温度、孵育时间、湿度和平板制备时间。至少使用五个浓度进行浓度-反应分析。
      注意：在使用前 12–24 小时制备平板。避免过度干燥，因其可能影响卵的存活率和幼虫运动。用包装材料包裹平板以减少脱水，并在处理光敏化合物时避光。将平板储存在清洁且最好是加湿的环境中（例如含湿滤纸的密封容器），以最小化实验变异性。
3. 多孔板中的卵孵化实验（中至高通量格式）
   注意：该格式广泛应用于 C. elegans 和寄生线虫研究中的中至高通量筛选，可在标准化条件下并行评估多种化合物及其不同浓度。
   1. 孔板制备与实验设计：使用 96 孔板（或根据通量需求选择其他格式）。提前规划板布局，明确药物浓度（按列排列）、重复次数（按行排列）以及对照组，包括仅缓冲液（M9 或水）和溶剂对照（例如 DMSO 或乙醇，终浓度与处理组相同）。
      注意：使用透明平底多孔板，以便在体视显微镜下通过透射 LED 照明直接观察和计数各孔中的卵和孵化出的 L1 幼虫。无需转移步骤即可在孔内直接定量，从而最大限度减少样本损失和操作误差。
   2. 向每个孔中预加载适当体积的药物溶液或对照溶液。所有孔中使用相等体积。
   3. 卵悬浮液的添加
      1. 制备浓度明确且充分混匀的卵悬浮液（参见第 2 节）。
      2. 向含有药物溶液的各孔中加入等体积的卵悬浮液。每孔终体积为 200 µL。
      3. 调整卵密度至每孔至少 30 个卵（理想范围为 30–100）。每孔卵数不应超过 100，因为过度拥挤会显著增加手动定量难度。个体卵难以分辨，而活动的 L1 幼虫会在孔内主动游动，降低计数准确性并增加实验变异性。
      4. 分装前轻柔混匀卵悬浮液，确保分布均匀。
   4. 小心加载孔板。避免引入气泡。移液操作应一致，并在不同条件间更换吸头以防止交叉污染。轻轻敲击孔板，确保所有内容物沉降至孔底。
   5. 孵育条件：从卵分离开始，在 20–22 °C、受控且湿润的条件下孵育 24 小时。
      注意：为减少变异性，避免使用外周孔或将外周孔填充缓冲液以减少蒸发。将孔板置于加湿环境中（例如含湿滤纸的密封容器）孵育，并在处理光敏化合物时避光。孵育期间避免不必要的移动。所有重复组的卵制备和药物暴露时间应保持一致，因为时间差异可能影响发育阶段和数据解读。

5. 评估与计数

1. 在卵子分离后24小时评估卵的孵化情况，确保对照条件在设定温度下已达到完全孵化。从卵子收集时刻开始计算该时间点，以保证胚胎有充分的发育时间。将在此阶段仍未孵化的卵子视为受处理影响。
2. 在体视显微镜下观察样品。针对每种条件（琼脂平板或多孔板），统计未孵化卵的数量以及已孵化L1幼虫的数量。
3. 扫描整个观察区域，包括平板边缘和孔板边界，因为活动的L1幼虫可能分布不均并积聚在这些区域。
   注意：使用体视显微镜直接计数，可在无需额外设备的情况下快速评估。各组间应保持一致的卵密度，每种条件至少设置3–5个技术重复，并使用不同批次的卵进行至少三次独立实验，以确保结果具有可靠的可比性。

6. 图像采集与记录

1. 使用配备数字相机的体视显微镜采集图像。对于琼脂平板，需记录每个象限；对于多孔板，则记录每个单独的孔。确保捕获所有区域，包括平板边缘和孔边界，因为幼虫可能在这些位置聚集。
   注意：通常使用10倍目镜和0.6倍至5倍的物镜（总放大倍数为6倍至50倍），可清晰观察计数区域内卵和L1幼虫的形态。采用透射LED照明。在所有实验条件下保持相机采集参数（亮度、曝光时间和对比度）恒定，以确保图像质量一致，并实现样品间的可靠比较。
2. 使用适当的图像采集软件获取图像，并利用图像分析软件进行处理与分析。在所有实验条件下保持分析参数一致，包括亮度、对比度、放大倍数、相同的采集区域/视野以及计数标准。
3. 根据所获取的图像定量统计未孵化卵和L1幼虫的数量。只有当幼虫完全从卵壳中孵出时，才视为已孵化。含有部分孵出幼虫的卵应归类为未孵化卵。在所有实验条件下应用相同的分类标准。
4. 将平板或多孔板在16–18 °C条件下继续孵育额外12–24小时，以评估观察到的卵孵化抑制现象是否可逆。在既定实验条件下，若此阶段仍未能孵化的卵，则视为受处理因素影响。

7. 数据分析

1. 计算卵孵化抑制率：
   未孵化卵的比例 =（未孵化卵的数量）/（卵和幼虫的总数）
2. 使用不同的卵批次进行至少 3–5 次独立实验。数据以均值 ± 标准差（mean ± SD）表示。
3. 采用非线性回归生成浓度-反应曲线，并确定 IC₅₀ 值。
4. 使用 Student’s t-检验对不同条件间进行统计学比较，并将统计学显著性定义为 p < 0.05。
5. 使用适当的统计学软件进行数据分析。

8. 使用反式肉桂醛和乙酸芳樟酯进行卵孵化试验的应用

注意：本研究并非围绕某一特定化合物展开，而是使用代表性试剂来说明在可比较的条件下，如何实施、控制和解读每种实验形式。选择反式肉桂醛（TCA）作为示例化合物，是因为其已有明确的表征结果，并且在本文所介绍的三种检测构型中均能稳定、可重复地抑制卵的孵化。需要强调的是，引入TCA的目的是展示实验方案的实施过程及典型的浓度-反应行为，而非确立不同形式之间的相对效力或性能比较。

1. 实验设置与化合物制备
   1. 提前 12–24 小时制备琼脂平板（每 35 mm 培养皿含 3 mL 琼脂），使用仅含琼脂的培养基（1.7% 溶于蒸馏水中）。标记平板，将其分为四个象限以便计数，在密封条件下储存以防止脱水，并在使用前平衡至室温。
   2. 用 DMSO 新鲜配制反式肉桂醛（TCA）储备液，并用无菌水或琼脂稀释，获得八个终浓度（0.05–0.7 mM）。所有处理组中 DMSO 的终浓度应保持在 0.2% 以下。分别以水、琼脂和/或 DMSO 作为阴性对照和溶剂对照。
   3. 在相同实验条件下，以 5 mM 的乙酸芳樟酯作为阴性化合物对照，用于评估该检测方法区分活性与非活性化合物的能力。
   4. 按前述方法制备同步化的卵悬浮液，并调整密度至每 100 µL 含 50–100 个卵。在所有实验体系中使用相等体积和相近数量的卵，以确保各处理组之间的一致性。
2. 使用参考化合物应用不同的实验体系
   1. 微量离心管中的短期暴露（高控制性体系）
      1. 将 500 µL 卵悬浮液与含 0.05–0.7 mM TCA 的 500 µL 处理液混合。在 18–20 °C 下孵育 6 小时，并在所有实验中保持一致的孵育时间。
      2. 孵育期间使用旋转仪持续轻柔振荡试管。
      3. 暴露结束后，在 3,420 × g 条件下离心 3 分钟（18–25 °C），小心移除上清液。用蒸馏水洗涤卵三次，以去除残留化合物，并限制在规定孵育期内的持续暴露。
      4. 将最终沉淀重悬于 240 µL 蒸馏水中，每种处理条件使用三个平板，每象限接种 20 µL 悬浮液至琼脂平板上。在卵分离后于 16–18 °C 下继续孵育 24 小时。
   2. 直接暴露于含药物的琼脂平板
      1. 通过将 TCA 溶液加入冷却至 50–55 °C 的琼脂中并轻轻混匀，制备含药琼脂平板，确保药物均匀分布。每板倒入约 3 mL 琼脂，并在使用前 12–24 小时制备好平板。
      2. 将卵直接接种到平板表面，接种密度与其他体系所用相当（每 100 µL 含 50–100 个卵）。此体系中不进行洗涤步骤。
      3. 在 16–18 °C 下孵育平板，直至卵分离后 24 小时。
   3. 多孔板检测法（中至高通量体系）
      1. 预先将 96 孔板加入药物溶液及对照组溶液。加入卵悬浮液，使每孔终体积为 200 µL，卵密度为每孔 50–100 个。
      2. 加样时避免产生气泡，并保持各孔体积一致，以确保分布均匀。在卵分离后于 20–22 °C 湿润条件下孵育 24 小时。
3. 图像采集与定量分析
   1. 在卵分离后 24 小时评估卵的孵化情况，此时对照组中孵化应已完成。在体视显微镜下对每种处理条件下的未孵化卵和 L1 幼虫数量进行计数。仔细检查平板边缘和孔边界区域，因为幼虫可能在这些区域聚集。
   2. 使用配备数字相机的体视显微镜采集图像用于记录。对琼脂平板的每个象限以及多孔板的每个孔系统性地成像。必要时使用图像分析软件辅助定量。
   3. 图像采集后继续孵育平板 12–24 小时，以评估观察到的孵化抑制是否可逆。
   4. 所有实验至少进行三次独立的生物学重复。

结果

TCA在所有实验条件下均表现出明显的浓度依赖性抑制卵孵化作用，如图1所示。每种检测配置的代表性浓度-反应曲线分别展示如下：微量离心管（图1A）、在琼脂平板上的直接暴露（图1B）以及多孔板（图1C）。

在微量离心管中测得的IC₅₀值为0.19 ± 0.0262 mM，在琼脂平板上为0.1758 ± 0.0463 mM，在多孔板中为0.2267 ± 0.0093 mM。这些数值作为每种检测方法所获得的浓度-反应关系的代表性示例展示。尽管观察到一些微小差异，但所有数值均落在相对较窄的范围内，表明不同实验配置之间具有整体一致性。重要的是，化合物特异性的反应可能随其理化性质和检测条件而变化；因此，这些数值不应被解释为在所有检测格式中对活性具有普遍预测性。

对照条件（水和DMSO）在所有实验条件下孵化率...

讨论

本研究提出了一种针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的简单且可适应的卵孵化检测平台，该平台基于三种互补的实验形式，分别在控制性、暴露动态和可扩展性方面有所不同。我们的结果支持这样一种观点：卵孵化检测应被视为一种灵活的方法学框架，可根据特定的实验目标进行调整，而非定义单一的最优方案。

基于微量离心管的实验体系为药物暴露提供了高度可控的环境，能够精确定义孵育时间、化合物浓度以及洗涤步骤。该配置特别适用于定量药理学分析和机制研究，因为它能够将暴露阶段与后续发育阶段分离开来。采用此体系获得的IC₅₀值（0.19 mM）反映了这些受控条件，其中化合物暴露时间受限，并在孵化前通过洗涤步骤降低残留药物水平。该设计最大限度地减少了因长期暴露带来的干扰效应，并有利于后续应用，例如将幼虫转移至接种细菌的培养板，以进一步评估其运动能力、生长情况或发育进程。类似地，将暴露阶段与恢复阶段分离的方法此前已在C. elegans药理学检测中得到应用^19,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌学琼脂	不列颠尼亚	B0101406	应新鲜配制（1.7 克溶于 100 毫升） H2O
漂白剂溶液	N/A	N/A	1.2 % (v/v) NaOH 和 0.5 M NaOH
离心	赛默飞世尔科技	Sorvall ST16R
离心	BiofugePICO 转移至离心管	Heraeus 75003235
数码相机	ToupCam	TP605100A	工业数字相机，可调焦距 USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	分子量：78.13
乙酸芳樟酯	SIGMA	CAS号：115-95-7	应新鲜配制
LB 培养基	N/A	N/A	10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，加去离子水至 1 L
M9 缓冲液	N/A	N/A	3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g  NaCl，0.25 g MgSO₄4 至1 L蒸馏水
小型旋转仪	BioSan	Bio RS-24
线虫生长培养基（NGM）	N/A	N/A	3 g NaCl，17 g 琼脂，2.5 g  将Bacto-Peptone加入1 L蒸馏水中，高压灭菌。添加1 mL胆固醇（5 mg/mL）。  1 mL CaCl₂ (1 M)、25 mL 磷酸钾缓冲液 (1 M, pH 6.0) 和 1 mL  MgSO4 (1 M)
培养皿（3 - 5 mm）	ThermoScientific. Nunclon Delta 表面	153066
培养皿（90 mm × 15 mm）	ExtraGene	1026160305	仅限实验室使用，聚苯乙烯。
移液器	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	版本 12.0
体视显微镜	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	三目体视显微镜（10×）–40倍总放大倍数；LED透射与反射照明
蔗糖	Cicarelli 实验室	艺术 841	60 %（v/v）蔗糖
96 孔组织培养板	生物膜	TCP 012096	聚苯乙烯，低蒸发盖。
ToupView	图普科技	N/A
反式肉桂醛（TCA）	Santa Cruz Biotechnology	J1712	应新鲜配制