高效培育及功能分析内寄生蜂Asobara japonica及其宿主Drosophila melanogaster的实验方案

摘要

本实验方案旨在通过优化的饲养方法、单次产卵感染实验以及RNAi介导的基因敲低技术，促进对Asobara japonica与Drosophila melanogaster之间寄生蜂-寄主相互作用的功能分析。

摘要

寄生是一种生物相互作用，其中一个生物体利用另一个生物体（宿主）的身体或资源，导致宿主遭受严重损害甚至死亡。在寄生性动物中，拟寄生蜂是物种多样性最丰富的类群之一，约占所有昆虫物种的20%。特别是内寄生蜂，可直接将卵产入宿主体内，并利用多种多样的毒液因子来操控宿主的发育、免疫和生理过程。作为对蜂类攻击的响应，宿主会尝试通过先天免疫机制清除拟寄生卵。然而，单个毒液成分如何在分子和细胞层面调控宿主生物学功能并促进成功寄生，目前仍知之甚少。本文介绍了一种标准化的实验室方案，用于饲养内寄生蜂Asobara japonica及其宿主Drosophila melanogaster。A. japonica 存在孤雌生殖和有性生殖两种品系，其中孤雌生殖品系具有较高的寄生成功率，便于稳定维持实验室种群，适用于基因组分析和寄生实验。我们优化了单次产卵感染实验以及基于双链RNA的基因敲低方法，用于毒液基因的功能分析。这些实验方案共同构建了一个实用的研究框架，可用于解析拟寄生蜂与宿主相互作用的分子机制，并将推动发育生物学、免疫学和生理学领域的后续研究。

引言

寄生是一种生活方式，指一种生物利用另一种生物的营养资源，这种现象在各类生物中广泛存在。据估计，所有已知生物中多达一半在其生命周期中表现出寄生行为¹。在寄生生物中，寄生蜂是一类特别多样化的类群，约占所有昆虫的20%²。它们利用多种节肢动物作为寄主，例如昆虫、蜘蛛和螨类，并在生活史和寄生策略上表现出显著的多样性³。这些特征使寄生蜂成为进化上和生态上最成功的昆虫类群之一。

寄生蜂与其宿主之间的相互作用被广泛研究，作为进化“军备竞赛”的模型系统。特别是，内寄生蜂会释放多种因子，包括毒液、共生病毒和胚细胞^4,5。这些因子可调控宿主的生理和发育过程，从而确保其在宿主体内成功发育。尽管已有上述进展，大多数寄生蜂物种中寄生现象背后的分子机制仍不清楚。其中一个主要限制因素是寄生蜂体型微小，阻碍了对其毒液成分进行生化鉴定。此外，在实验室条件下维持寄生蜂及其宿主发育阶段的同步也存在技术上的挑战。

下一代测序及其他组学技术的最新进展，使得即使在体型微小的寄生蜂物种中也能开展全基因组范围的分析。这些方法为研究以往难以触及的分子机制开辟了新的途径，使寄生蜂与宿主相互作用的研究达到前所未有的分辨率。在此背景下，本实验室致力于 Asobara japonica Belokobylskij （膜翅目：茧蜂科），一种最初在日本鉴定的物种^6,7,8. A. japonica 包含一种孤雌生殖型品系，其中雌性个体无需交配即可产生后代。这一特性使我们能够收集大量基因型一致的基因组DNA，用于全基因组测序⁹此外，该物种寄生范围广泛 黑腹果蝇 物种，包括模式生物 D. melanogaster, 哪个 由于其成熟的饲养条件和精确界定的发育阶段，该体系在实验上具有显著优势，可实现可重复的感染实验，并准确控制寄生性天敌的发育过程¹⁰.

在寄生过程中 A. japonica雌性黄蜂将毒液与一颗卵一同注入蝇类幼虫体内，黄蜂幼虫随后在宿主体内与宿主共同生长。值得注意的是， A. japonica 对寄主具有较高的寄生成功率 D. melanogaster 使该寄生蜂-寄主组合成为一个强大的实验模型。本文中，我们描述了稳定的饲养方案、单次产卵感染检测方法，以及基于双链RNA（dsRNA）的基因敲低方法 A. japonica 这些方案为解析寄生蜂与宿主相互作用背后的分子机制提供了可靠的框架。

方案

D. melanogaster 和 A. japonica 的同步化培养方法的示意图见图1。

1. 实验室中培养宿主果蝇 Drosophila melanogaster 

1. 将所有实验动物饲养在 25 °C 、相对湿度 50–60% 的环境中，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。使用野生型品系 Oregon-R (OR) 作为 A. japonica  的宿主（图 2A）。
2. 将成虫转移至含有标准玉米粉-酵母-琼脂培养基（0.55% 琼脂， 表 1）的新培养管中。在管壁上标注转移日期和品系名称 "OR"。
3. 转移后一天清除这些成虫，以防止食物中卵的数量过多。确保后代幼虫在食物表面取食。
   注意：作为参考标准，每管培养基（φ30×100 mm）中保留约 200–250 枚卵。较高的卵密度可能降低寄生成功率，并增加宿主和寄生蜂发育的变异性。
4. 在步骤 1.2 之后第四天，将一勺果蝇幼虫（产卵后 4 天，dAEL）转移至新的食物管中。将这些幼虫保持不接触寄生蜂的状态，用于下一代的繁殖。此操作也有助于控制管内宿主幼虫的密度。

2. 在实验室中饲养内寄生蜂Asobara japonica

1. 使用孤雌生殖品系东京（TK）和有性生殖品系伊里奥莫泰岛（IR）（图2B）。前者仅包含雌性个体，后者则包含雌性和雄性个体。雄性比雌性早2至4天羽化。因此，在转移前需通过产卵器确认雌性的存在。
2. 将10–20只成年雌蜂直接从保种管转移至含有4日龄幼虫（dAEL）的试管中。在试管上标注转移日期及品系名称"TK"或"IR"。饲养条件与步骤1.1相同。
3. 让成年雌蜂在果蝇幼虫体内产卵。在1至2天后清除这些成年雌蜂，以防止多重寄生，避免导致寄主死亡。在步骤2.2完成10天或更久之后，移除未被寄生而羽化的成年果蝇  。
4. 在步骤2.2完成两周后，成年雌蜂开始从寄主果蝇的蛹壳中羽化。将这些新羽化的成年雌蜂转移至含有滤纸的新培养管中，滤纸上提供25%葡萄糖和50 mM维生素C溶液。滤纸碎片需在130 °C下灭菌2小时。在滤纸上提供该溶液可促进产卵行为并延长成年雌蜂的寿命。我们采用维生素C增强产卵行为的方法，灵感来源于对Drosophila 的研究¹¹。

3. 单次产卵感染实验

1. 同步用于感染实验的果蝇幼虫的发育阶段。
   1. 将成虫果蝇放入含有葡萄汁琼脂板（3% 琼脂）的 50-mL 离心管中，琼脂板表面涂有新鲜酵母糊，让果蝇产卵 24 小时。
   2. 收集在葡萄汁琼脂板上新孵化的一龄幼虫，并将其转移至含有 2–3 g 果蝇食物糊（果蝇食物与适量水混合）的小瓶（12 mL）中。每瓶放入 20–30 条幼虫。将果蝇幼虫置于 25 °C 条件下培养。
2. 在适当时间点，准备一个直径为 4 cm 的培养皿，其中加入一层薄而均匀的果蝇食物糊，覆盖面积约为 1.5–2.0 cm 直径（以下简称感染实验区域）。除感染实验区域外，另准备一个新的小瓶（12 mL），内含适量果蝇食物糊，用于感染实验后培养宿主幼虫。
3. 收集已同步发育阶段的幼虫，并将其转移至含有去离子水（电阻率 = 15 MΩ·cm，25 °C）的培养皿中。轻轻搅动幼虫以清洗其体表残留的食物。
4. 清洗后，使用无绒纸巾轻轻吸去幼虫表面多余水分，因为过多水分会干扰黄蜂在感染实验区域中的产卵行为。随后将幼虫转移至感染实验区域。此步骤可提高感染实验期间幼虫的活动性。
5. 使用流速为 5 L·min^-1、压力为 0.2 MPa 的 CO₂ 气体麻醉成虫黄蜂。然后，轻柔地将约三只雌性黄蜂放入感染实验区域中。盖上培养皿盖子，让黄蜂在果蝇食物糊上恢复活动。
6. 在体视显微镜下观察这些黄蜂的产卵行为（放大倍数：10× 至 15×）。
   注意：当黄蜂接触到移动的果蝇幼虫时，会迅速将其产卵器插入果蝇体内并注入毒液成分。尽管果蝇幼虫会扭动挣扎，但立即出现麻痹现象。随后，黄蜂腹部振动，并将卵产入宿主幼虫体内，之后收回产卵器。该产卵行为称为感染。
7. 感染完成后，打开培养皿盖子，将已感染的果蝇幼虫转移至 第 3.2 步准备的含有果蝇食物糊的新小瓶中。为标准化感染时间，应在 15 分钟内完成整个感染实验。
8. 在小瓶上标注实验信息，例如日期、样品名称、感染时间及个体数量。将这些小瓶塞好后置于湿润容器中，并在 25 ˚C 条件下培养。

4. 通过dsRNA注射生成RNA干扰（RNAi）寄生蜂

1. 使用长度为400 bp或更长的dsRNA进行dsRNA介导的基因敲低（RNA干扰，RNAi）的合成 体外 基于转录的dsRNA合成系统。dsRNA样品应保存在-20至-80 °C，直至使用。详细方案如前所述⁹.
2. 准备 5.5 用于放置黄蜂的含2%琼脂的培养皿。将每个培养皿填充至三分之二，以制备用于注射的较厚琼脂层。
3. 将一块用水润湿的无绒布放在塑料培养皿的盖子上。
4. 在感染后第7天（dpi）从试管中收集寄主果蝇蛹，并将其放置于第4.3步准备好的无绒纸巾上。向试管壁加入一滴水有助于使寄主果蝇蛹壳从试管上脱落。
5. 在体视显微镜下（放大倍数：20）×），用镊子移除寄主果蝇的蛹壳，露出蜂体。在感染后第7天，大多数蜂处于蛹期，此时头部、胸部和腹部结构清晰可辨，蜂体不活动。
6. 将取出的黄蜂个体置于第4.2步制备的琼脂平板上，使其体轴方向保持一致。将20-30只黄蜂背面向上排列成一至两行。用无绒纸巾擦去琼脂平板上多余的水分，防止黄蜂滑动。
7. 根据制造商的说明，安装注射装置和体视显微镜（图 3A使用配备玻璃毛细管针头的显微注射系统，以精确控制注射体积和注射速度。 将琼脂平板放置好，使黄蜂头部朝向注射针尖端。注射体积为 50 nL·黄蜂^-1 且注射速度为 50 nL·秒^-1 在注射器上。
8. 使用拉针仪制备玻璃毛细针。通过调节加热温度可控制玻璃毛细针的形状。
9. 将玻璃毛细管针置于针尖研磨器上，角度为30–35°将针尖研磨至长度达到0.04 mm（目镜测微尺上的四个刻度）， 图3B).
10. 注射前立即解冻dsRNA。dsRNA的浓度为0.25-1 µg·µL^-1为便于观察，将双链RNA溶液用蓝色染料（赤藓红二钠盐，2% 质量分数）染色·体积^-1使用微量移液器吸头，将含蓝色染料的dsRNA溶液吸入玻璃毛细管中。4 µL足以用于注射30只黄蜂个体。确保溶液中无气泡存在。
    注意：加载dsRNA溶液后，用指甲轻轻敲击针头侧面，以去除针内滞留的气泡。残留气泡可能阻碍溶液流动，影响注射成功。
11. 使用1 mL注射器和针头，将矿物油注入玻璃毛细管的未填充部分，确保毛细管内无气泡残留。
12. 将含有dsRNA溶液和矿物油的玻璃毛细针连接至针头夹持器，然后安装到显微注射装置上。
13. 调整琼脂平板和注射器上玻璃毛细针的位置，使玻璃针与琼脂平板表面呈30–45度角。° 相对于黄蜂身体的角度（图3A).
14. 将玻璃毛细管针插入黄蜂体背侧，位置略偏于背中线外侧。将dsRNA溶液微量注射入体内。注射的dsRNA溶液可通过蓝色染料观察到。 (图3C).
15. 注射后，将琼脂平板置于潮湿环境中 容器（70-80% 相对湿度）中，并在 25 °C 将培养皿置于培养箱中一周，直至成虫羽化。应移除受伤的蜂体，以防止细菌污染。
    暂停点：在步骤4.6中，蜂蛹可在琼脂平板上放置数小时后再进行注射。针头可预先制备（步骤4.8和4.9），但随时间推移容易发生堵塞。新制备的针头通常能提供更可靠的注射效果。

结果

无性系与有性系的 Asobara japonica
A. japonica 广泛分布于日本各地。在主岛上以孤雌生殖的雌核发育品系为主，而在包括奄美大岛和西表岛在内的亚热带岛屿上则分布着两性生殖的雄核发育品系。^8,12在有性生殖品系中，雄性比雌性早几天羽化，因此这些品系的成虫转移时间有所不同。孤雌生殖中的雌性生殖 A. japonica 由感染引起 Wolbachia一种母系遗传的内共生细菌¹³消除 Wolbachia 通过抗生素处理导致雄性个体的产生^9,14，以及移植 Wolbachia 诱导孤雌生殖¹⁵无性繁殖和有性繁殖品系 A. japonica

讨论

本研究建立了一个多功能实验平台，用于在分子水平上研究寄生蜂与宿主之间的相互作用。通过优化饲养条件、单次产卵感染实验以及RNAi实验方案，我们提供了一个可靠的系统，用于研究寄生蜂来源因子的功能。该平台将有助于未来揭示寄生蜂调控宿主发育机制的研究，同时也可能为生物害虫防治策略的开发提供支持。

Wolbachia感染的A. japonica TK品系为研究寄生现象提供了一个高度可重复的实验系统。在许多寄生蜂-寄主研究中，实验结果往往存在较大变异，寄主存活率和寄生蜂成功率对环境和生理条件高度敏感。相比之下，TK品系表现出持续稳定的高寄生成功率，有效地形成了一种“寄生蜂主导”的状态，使感染结果基本一致。此外，由于该品系为孤雌生殖品系，个体间具有相同的遗传背景，从而减少了实验中的个体差异。这种可重复性使得寄生过程能够被可靠地追踪，并有助于对寄主应答及寄生蜂来源因子进行定量分析。

此外，孤雌生殖通过产生高度均一的基因组DNA，极大地促进了基因组分析，这对于高质量的基因组组装至关重要

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 离心管	Greiner Bio-One	210261	感染实验
1 mL 注射器	TERUMO	SS-01T	dsRNA 注射
琼脂	Daisin, Ltd.	P-700	饲养
Asnol 培养皿 φ40×13.5 mm	As One Corporation	1-8549-01	感染实验
Asnol 培养皿 φ55×17 mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA 注射
蓝色染料（依柔红二钠盐）	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA 注射
对羟基苯甲酸丁酯	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	饲养
CO2 减压调节器	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	感染实验
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	LSM700	图像分析
玉米粉	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	饲养
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	细胞核染色，1:10000
去离子水	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	感染实验
双级玻璃毛细管拉制仪	Narishige	PC-10	dsRNA 注射
Fiji	NA	https://fiji.sc	图像分析
滤纸	Advantec	ITEM 526	饲养
果蝇饲养管	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	饲养
果蝇饲养管塞	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	饲养
镊子	Dumont Biologie	11252-20	解剖
冷冻柜，-20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	样品储存
冷冻柜，-80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	样品储存
载玻片	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	感染实验
葡萄糖	Showa Sangyo Co., Ltd.	不可用	饲养
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA 合成
培养箱	Panasonic	MIR-254-PJ	饲养
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA 合成
玻璃毛细管研磨仪	Narishige	EG-401	dsRNA 注射
矿物油	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA 注射
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA 注射
Nanoject 玻璃毛细管	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA 注射
pBluescript KS (+) 质粒	不可用	不可用	dsRNA 合成
pBluescript SK (-) 质粒	不可用	不可用	dsRNA 合成
PrimeScript 逆转录酶	Takara	2680A	dsRNA 合成
丙酸	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	饲养
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	感染实验，dsRNA 注射
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（含gDNA去除剂）	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus 试剂	Takara	9108	qRT-PCR
小瓶（12 mL 试管）	Sarstedt	REF 58.487	感染实验
小瓶塞	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	感染实验
刮勺	As One Corporation	6-522-02	饲养
方形培养皿	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA 注射
体视显微镜	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	感染实验
体视显微镜	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA 注射
T7 RiboMAX Express RNAi 系统	Promega	P1700	dsRNA 合成
Thermal Cycler Dice Real Time 系统	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA 合成，qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	不可用	qRT-PCR
维生素C，L-抗坏血酸	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	饲养
Welch's 100% 葡萄汁	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	感染实验
酵母	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	饲养