显微镜观察与染色：革兰氏染色、荚膜染色与芽孢染色

细菌是一类微小的生物体，具有多种区别性特征，例如细胞形态、细胞排列方式、是否产生荚膜以及是否形成芽孢。这些特征均可通过染色进行观察，有助于不同细菌种类的鉴定与分类。

为了观察细胞形态和排列方式这两个特征，我们可以采用一种称为革兰染色的简单技术。在此方法中，将结晶紫染液作用于已通过加热固定在载玻片上的细菌。接着，向载玻片上添加革兰碘液，使结晶紫与革兰碘液形成不溶性复合物。随后使用脱色剂进行处理，凡是具有较厚肽聚糖层的细菌会保留紫色，因为脱色剂难以穿透该结构。这类细菌被称为革兰阳性菌。

革兰氏阴性细菌具有较薄的肽聚糖层，在脱色剂作用下会脱去紫色染料，从而失去紫色。然而，当加入沙黄复染剂时，它们会被染成粉红色，这是因为沙黄可与细胞外层的脂多糖层结合。染色后，可观察细胞的形态、大小和排列方式（如链状或簇状），这有助于进一步的分类与鉴定。

微生物学家工具箱中的另一种有用技术是荚膜染色法，用于观察某些细菌细胞外部的荚膜结构。由于荚膜具有非离子性质且容易排斥染料，简单的染色方法无法奏效。因此需采用负染色技术，即先用酸性染料（如刚果红）染色背景，再用结晶紫对细菌细胞进行染色。这样，若有荚膜存在，其周围将呈现清晰的透明晕圈。

此处介绍的最后一种主要染色技术可用于判断所研究的细菌是否形成芽孢。在不利条件下，某些细菌会产生芽孢（endospores），即一种休眠态、坚韧且不具繁殖能力的结构，其主要功能是确保细菌在环境压力（如极端温度或脱水）下存活。然而，并非所有细菌种类都能形成芽孢，且由于芽孢对许多染料具有不透性，常规染色方法难以对其进行染色。Schaeffer-Fulton 法使用孔雀绿染料对固定在载玻片上的细菌进行染色，随后用水冲洗载玻片，再用沙黄进行复染。营养细胞呈粉红色至红色，而存在的任何芽孢则呈绿色。在本视频中，您将学习如何执行这些常见的细菌染色技术，并使用光学显微镜观察染色样本。

开始实验前，将长发束起，并穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。

然后，用实验室擦拭纸清洁一张新的载玻片。接着，用移液器吸取10 µL的1×磷酸盐缓冲液至第一张载玻片上。然后，使用无菌的移液器吸头从LB琼脂平板上挑取单个细菌菌落。将菌落于液滴中涂布，形成一层薄而均匀的菌膜。将载玻片放置在实验台面上，使其完全自然晾干。

干燥后，点燃本生灯以对细菌进行热固定。用镊子夹住载玻片，将细菌面朝上多次通过火焰，注意不要在火焰中停留过久，以免细胞变形。

现在，在水槽上方操作，将载玻片保持水平，滴加数滴革兰氏结晶紫溶液，完全覆盖细菌涂片，然后将载玻片放置在实验台上静置45秒。接着，将载玻片倾斜，从上方轻轻冲洗水流至载玻片顶部，注意不要直接冲到细菌涂片上。随后，再次将载玻片保持水平，滴加革兰氏碘液，完全覆盖已染色的细菌，静置45秒。然后，按照前述方法小心冲洗去除碘液。在保持载玻片倾斜的状态下，向载玻片滴加数滴革兰氏脱色剂，使其流经染色的细菌区域，直至流出液变为无色，约持续5秒。立即按照前述方法用水冲洗。此步骤可防止涂片过度脱色。接下来，再次将载玻片保持水平，滴加革兰氏沙黄复染液，完全覆盖染色的细菌。45秒后，按照前述方法用清水轻轻冲洗去除沙黄染液，然后用纸巾轻轻吸干。

最后，在玻片上直接滴加一滴镜油，然后使用配备100倍油镜的光学显微镜观察玻片。

开始此染色方案时，首先应穿戴好适当的个人防护装备，然后确保将要使用的载玻片是清洁的。

接下来，准备溶液。配制1%结晶紫溶液：将0.25克结晶紫粉末与25毫升蒸馏水混合，涡旋振荡至完全溶解。然后，配制1%刚果红溶液：将0.25克刚果红粉末与25毫升蒸馏水混合，涡旋振荡至完全溶解。接着，用移液器吸取10微升刚果红溶液滴加到载玻片上。使用一支洁净无菌的移液器吸头，从LB琼脂平板上挑取单个细菌菌落。然后将该菌落涂抹于染液中，形成一层薄而均匀的涂片。将载玻片在空气中彻底干燥5至7分钟。待涂片干燥后，用足够的1%结晶紫溶液完全覆盖涂片，染色1分钟。随后，将载玻片倾斜，从上方轻轻冲洗水流至载玻片顶部，注意避免直接冲到细菌区域。保持载玻片呈45度角，直至其完全自然干燥。最后，在载玻片上滴加一滴镜油，然后使用100X油镜在光学显微镜下观察。

进行芽孢染色时，首先通过将0.125克孔雀石绿粉末与25毫升蒸馏水混合，配制0.5%的孔雀石绿溶液，然后涡旋振荡至完全溶解。接下来，用移液器吸取10微升1×PBS溶液，滴加到载玻片中央。随后，使用无菌移液器吸头从LB琼脂平板上挑取单个细菌菌落。将细菌在液滴中涂布，形成一层薄而均匀的菌膜。现在将载玻片置于实验台面上，使其完全自然干燥。干燥后，点燃本生灯以进行细菌的热固定。将载玻片多次通过蓝色火焰，细菌面朝上。待载玻片冷却后，在已热固定的涂片上覆盖一片预先裁好的镜头纸。接着，将电热板调至最高温度，并将一杯水加热至沸腾。

将石碳酸绿溶液浸透镜头纸，用镊子夹取载玻片置于盛有沸水的烧杯上方，蒸气加热5分钟。根据需要，逐滴添加染液以保持镜头纸湿润。接着，再次使用镊子从烧杯中取出载玻片，移除并丢弃镜头纸。让载玻片冷却2分钟。在水槽上方操作，将载玻片倾斜，轻轻用水流冲洗载玻片表面。然后将载玻片放平，滴加沙黄染液，使其完全覆盖载玻片。静置1分钟。随后，将载玻片倾斜，按前述方法进行冲洗。将载玻片置于实验台面上自然晾干。最后，在载玻片上直接滴加一滴镜油，使用100X油镜在光学显微镜下观察。

在革兰氏染色实验中，可观察到两种不同颜色的染色结果。深紫色染色表明细菌为革兰氏阳性菌，其保留了结晶紫染料。相反，红粉色染色是革兰氏阴性菌的特征，这类细菌则被沙黄复染剂着色。此外，革兰氏染色后还可观察到细菌的不同形态和排列方式。例如，可以区分球状的球菌与杆状的杆菌，或识别形成长链的细菌，以及与通常成团聚集或单个存在的细菌进行鉴别。

在荚膜染色的显微镜图像中，细菌细胞通常被染成紫色，载玻片的背景则应被深色染料染色。在这一深色背景下，如果存在荚膜，则会呈现为细菌细胞周围清晰的光环。

最后，在芽孢染色中，营养细胞会被沙黄复染剂染成红色。如果样品中存在芽孢，则芽孢会保留孔雀绿染料，呈现蓝绿色。