斑马鱼胚胎中mRNA和吗啉代反义寡核苷酸的显微注射

该实验首先制备吗啉代寡核苷酸（morpholino）和体外转录的带帽mRNA。用移液器吸取含有吗啉代的溶液，并使用显微测微尺在单细胞阶段校准注射体积。随后收集斑马鱼胚胎，并将其排列在微注射板中，用于卵黄微注射。

将工作液注射到细胞下方的卵黄中，利用细胞质流动使溶液进入细胞以进行显微注射。在完成注射后，将溶液注入细胞质中。将胚胎在28.5摄氏度的E3培养基中孵育，并在后续发育阶段观察目标表型。

大家好，我是来自耶鲁大学医学院遗传学系Sasha博士实验室的Shiloh Yuen。今天我们将演示一种可靠的显微注射技术，用于在斑马鱼中进行mRNA过表达和吗啉代寡核苷酸基因敲降研究。我们实验室利用该方法研究纤毛在囊性肾病中的作用。

那么，让我们开始吧。研究基因功能的一个有力方法是将体外转录的带帽RNA微量注射到斑马鱼胚胎中。在本演示中，我们将微量注射一个带有EGFP标签的转录本，并通过活体胚胎中GFP的表达作为注射成功的可见读出信号。

首先，我们将对目标转录本进行体外加帽RNA转录反应。在我们的实验室中，通常将目标A-C-D-N-A序列插入PCs two plus载体，并利用M message M machine SP six试剂盒进行体外合成反应，以大量制备带帽的RNA。接下来，我们通过RN easy mini试剂盒纯化RNA样品，或采用苯酚-氯仿抽提结合异丙醇沉淀的方法进行纯化。

仔细测定RNA样品的浓度，并在-80摄氏度保存，直至注射当天使用。将RNA样品解冻后轻轻涡旋混匀，短暂离心。随后用无菌水配制工作液，其中酚红终浓度为0.025%至0.05%。酚红可作为可见标记物，用于指示溶液是否成功注入胚胎。

在此，我们将配制含有0.05%酚红的100纳克/微升EGFP mRNA工作液。最后，将工作液样品置于冰上，并将RNA原液放回–80摄氏度保存。待准备注射该样品时，继续进行形态学实验的制备。

吗啉代反义寡核苷酸被广泛用于通过阻断靶向蛋白的翻译或修饰前体mRNA剪接来调控基因表达。斑马鱼中的吗啉代寡核苷酸作为一种强大的反向遗传学工具，可通过抑制基因功能实现研究目的。本文中，我们将显微注射一种靶向pkd2翻译起始位点的吗啉代寡核苷酸。我们常规使用来自Gene Tools LLC公司、针对特定目的基因专门设计的吗啉代寡核苷酸，浓度为300 M。

然后加入 100 微升无菌水，配制成 3 毫摩尔的储备液，分装后于 -20 摄氏度保存，直至注射当天使用。将 morino 溶液在 65 摄氏度加热 5 分钟，随后立即在冰上快速冷却，并短暂离心。此步骤可使寡核苷酸中的任何二级结构变性，并确保溶液完全溶解。

接下来，我们将通过将Morpho溶液在无菌水中稀释，并加入终浓度为0.025%至0.05%的酚红，来配制工作液。在本演示中，我们将配制含有0.05%酚红的0.5毫摩尔PKD two morino工作液。配制好的工作液置于室温保存，并在准备注射该样品时进行微量移液器上样。

首先，我们需要制备用于注射的微移液管。这是通过在微移液管拉制仪中加热并拉伸BOS硅酸盐玻璃毛细管来完成的。一旦拉制成针状，便将其放置在培养皿中，并置于少量黏土或胶带之上保存。

接下来，我们将通过在含有楔形槽的 XE 三型培养基平板中倒入 1.5% 琼脂糖来制备显微注射用腔室平板。这将为注射过程中固定胚胎提供一种简便的方法。琼脂糖腔室平板随后静置凝固，并于 4°C 保存，直至使用前。

开始填充微量移液器时，使用镊子或手术刀片切割其远端尖部，以形成一个在50倍解剖显微镜下刚好可见的开口。随后加入2 µL的工作溶液。

将工作溶液滴加到盖玻片上，将微量移液器的尾部连接至装有导管的5毫升注射器（导管连接于皮下注射针头），并将微量移液器远端尖端轻轻浸入工作溶液液滴中。注意避免损坏微量移液器的尖端。通过拉动注射器活塞，使工作溶液从微量移液器的远端流出。

接下来，我们将校准微量移液器的注射体积。在微米尺载玻片上放置一滴矿物油，并打开压力脉冲微量注射装置的电源和气源。然后，将微量移液器连接到微量注射装置的移液器固定架上。

显微注射器由压力调节，通过在解剖显微镜下踩下脚踏板来启动注射。使用显微注射器将工作液滴加到微米级油滴上，以测试注射体积。当液滴以球形漂浮在油面上时，测量其直径。

调整注射的持续时间和压力，以精确校准注射体积。此步骤有助于提高显微注射实验的可重复性。在本演示中，所有显微注射均采用直径为0.15毫米的液滴。

最后，当注射体积校准完成后，使用显微注射器上的保持旋钮防止微量移液管回吸和泄漏。现在开始准备斑马鱼胚胎。斑马鱼通常在每天清晨的最初几个小时内随机交配，为开始实验准备，需在单细胞期收集胚胎，并将其置于1 X E3培养基中。

使用3毫升移液管，将胚胎排列在显微注射板的楔形槽中。移除培养基，使胚胎浅层浸没而不过度淹没。此步骤有助于胚胎沉降至槽底，并促进显微注射针穿透卵壳。

现在我们开始注射。首先，使用微量移液器操作胚胎，使单细胞期胚胎的细胞质在解剖显微镜下可见。注意不要折断微量移液器的尖端，用移液器先穿透胚胎的绒毛膜，再穿透卵黄，以便将物质注入胚胎内。

在本演示中，我们将首先将工作液直接显微注射到细胞下方的卵黄中，借助细胞质流动和扩散作用使工作液进入细胞内。由于工作液中添加了酚红，该流动过程可见。由于这是单细胞胚胎，可采用徒手操作或使用显微操作仪进行注射。

我们还将演示直接注射到细胞质中的方法。直接显微注射入细胞更为可靠，但耗时较长，因为需要对胚胎进行正确的定向并掌握适当的显微注射技术。由于细胞膜比卵黄膜更坚韧，通常通过卵黄插入微量移液器进入细胞会更快捷。

将细胞质朝向凹槽底部，并使动物极朝下，同时保持手部稳定，可能有助于本注射方法的操作。显微注射后，将胚胎放入含有E3培养基的培养皿中，在28.5摄氏度条件下孵育，以确保胚胎正常发育。在随后数小时至数天的胚胎发育过程中，观察胚胎中感兴趣的表型。

为了验证显微注射的成功，我们将从盾牌期开始，通过活体胚胎整体荧光显微镜观察发育中胚胎内GFP的表达。该表达构建体在胚胎发育早期事件中表达最强，并随着发育进程通常会逐渐减弱，这是由于注射的加帽RNA逐渐降解，且蛋白表达水平依赖于所表达蛋白的稳定性。根据以往已发表的研究结果，我们预期PKD2吗啡肽能够模拟在PKD2突变型斑马鱼中观察到的躯体背侧轴弯曲，并在受精后约2至3天出现肾囊肿。

我们刚刚向您展示了一种稳健的显微注射技术，可用于在斑马鱼中进行 mRNA 过表达和吗啉代寡核苷酸基因敲降研究。进行此操作时，请务必记住：注射时需保持手部稳定。就此完毕。

感谢观看，祝您的实验顺利。