光遗传刺激突触电位的通道视紫红质2介导方法 果蝇 神经肌肉接头

该实验流程首先从培养果蝇开始。将具有适当基因型的三龄幼虫置于含有全反式视黄醇的食物中进行培养。每个幼虫均以头部和尾部固定。

然后将 FLA 平放。接着切断脑部和后部神经以终止节律性运动活动。随后，调节并聚焦带有控制盒的蓝色 LED 光源，使其照射在制备样本上。

最后，使用锋利的电极刺入第六块肌肉，然后通过电压源传递光脉冲。大家好，我是来自布兰迪斯大学生物学系莱斯利·格里菲斯博士实验室的Nicholas Marstein。

大家好，我是来自格里菲斯实验室的Stefan Pulver。今天我们将向您展示如何在黑腹果蝇幼虫的神经肌肉接头处利用channelrhodopsin-2（ChR2）诱导突触电位。我们实验室使用该方法研究果蝇的突触生理学。

我们还利用它来向学生讲授突触生理学并开展教学实验课程。现在让我们开始吧。要启动本实验方案，需在分别装有标准果蝇培养基的培养瓶中，维持UAS channel redsin two和okay, 3 7, 1 gal four果蝇品系。

从3至7日龄的四条果蝇品系中收集处女蝇，并从UAS channel redsin的两条品系中收集雄蝇。接下来，制备含有1毫摩尔全反式视黄醇（all trans retinol）或aTR的果蝇培养基。具体操作为：将常规果蝇培养基放入微波炉中加热约一分钟，使其融化。

待培养基融化后，静置冷却约30至60秒，然后每10毫升果蝇培养基加入100微升溶于100%乙醇的100毫摩尔TR。当含有TR的培养基试管准备就绪后，将收集的雄性和雌性果蝇分别放入各试管中。将试管置于22至25摄氏度的避光环境中，使果蝇交配并产卵，等待四到五天，直至观察到三龄幼虫。

此时，可以处理掉成年果蝇。现在我们已准备好进行电生理记录装置的搭建。将任意解剖显微镜目镜连接至带散热片的蓝色LED光源。

使用支架和夹具将磁性底座固定到目镜和LED光源上。将磁性底座放置在电生理装置的气浮台上。接着，将光源连接至控制电路，然后将控制电路连接至外部电压源。

我们使用由AD Instruments公司生产的Power Lab电生理数据采集系统的电压输出。连接电压源后，向控制电路施加1至5伏的脉冲，以激活蓝光；调整磁性底座和光源，直至蓝光光束聚焦于幼虫解剖区域。完成适当调整后，即可进行幼虫解剖操作。

开始解剖时，将六根0.1毫米的细针插入盛有Sogar培养基的培养皿底部。从培养基中取出三龄幼虫，放入任意塑料培养皿中。用生理盐水冲洗幼虫，以去除附着在幼虫体表的培养基。

然后将幼虫放置在解剖皿中靠近拉直的细针附近，并向皿中加入生理盐水至半满。调整幼虫的方向，使其背侧表面可见两条银色的管状结构，这些银色管状结构即为气管。

将一根大头针直接插入气管束之间的尾部。固定住幼虫，并将第二根大头针插入其头部。插入大头针时，务必沿纵轴方向将身体拉直。

使用剪刀在尾部附近做一个小切口。沿身体长度方向继续切开。注意将剪刀尖端略微抬起，以避免损伤腹侧神经和（或）体壁肌肉。

在动物的四个角上放置四根大头针。现在打开中段。将大头针插入解剖皿中，以便对动物进行剖片处理。

同时用镊子和剪刀固定标本，使其保持紧绷。移除动物的消化器官、气管和脂肪体。用生理盐水冲洗标本。

清洗后，使用显微剪刀找到样本的额叶和腹神经节。在额叶后方小心剪断腹神经节。解剖完成后，进行蓝光刺激并记录肌肉反应。

进行肌肉记录时，拉制一个电阻为10至20兆欧的电极。使用电子电极拉制仪，将拉制好的电极填充3摩尔的KCl溶液。将填充完毕的电极放入电极夹持器中。

现在将幼虫标本置于解剖显微镜下的装置上。调节蓝光，使解剖后的标本位于光束中心。使用显微操作器，在幼虫任一体壁节段中识别第六肌或M六肌，小心地将电极插入M六肌，并观察是否出现快速超极化肌肉反应。

静息膜电位应在负30毫伏至负70毫伏之间。电极正确插入后，向控制电路施加20至100毫秒的电压脉冲。逐步增加供给控制电路的电压。

注意观察肌细胞中的兴奋性突触后电位。以下是一个代表性结果，显示了由短暂光脉冲诱发的兴奋性突触后电位。此处所示的兴奋性突触后电位幅度来自两个已知均能引发兴奋的运动神经元的总和幅度。

六号肌。较低强度或较短时间的光照可暴露出单个运动神经元引发的微小幅度兴奋性突触后电位。我们刚刚向您展示了如何在果蝇神经肌肉接头处进行通道视紫红质-2介导的突触电位刺激。

进行此操作时，重要的是要注意在解剖过程中不要损伤标本的体壁。还需要注意，尽管标本在解剖后可能暂时处于过度兴奋状态，但随着时间推移会逐渐平静下来，从而获得良好的记录结果。刺入肌肉时，应小心避免穿透第一层肌肉进入体壁深处。

当电极插入体壁时，有时可能会记录到超极化电位，但实际上并未进入肌细胞。情况就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。