斑马鱼脑室注射

该实验流程首先对斑马鱼胚胎进行分期。当胚胎发育至目标时期时，将其从卵膜中取出。接着，用移液器吸头在包被有aros的培养皿上打孔，用于固定胚胎，然后将胚胎轻轻放入孔中，使其尾部朝下。

胚胎固定后，将荧光染料通过后脑小心地注入胚胎的脑室腔内。脑室注射完成后，对胚胎进行成像，并使用 Photoshop 处理数据。大家好，我是来自马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院怀特黑德生物医学研究所 Hazel Sieve 博士实验室的 Jennifer Gutman。

今天，我们将向您展示一种斑马鱼脑室注射的方法。我们在实验室中使用该方法来研究活体斑马鱼中脑室的形成以及神经上皮的形态发生。由于斑马鱼胚胎具有透明的特性，对脑室形态进行表征可能会比较困难。

该技术是一种有效且简便的方法，可用于区分充满液体的腔隙与周围组织，并用于表征可能存在脑室形成缺陷的突变胚胎。现在我们开始操作。在进行斑马鱼脑室注射前，首先需要制备注射针。

使用 Sutter 仪器的针极拉制毛细玻璃针。然后将毛细玻璃针填充荧光染料，例如德克萨斯红葡聚糖。接着，将填充好的针安装在显微注射装置的显微操作器上。

将针头以一定角度切割至合适尺寸。为形成斜面针尖，需测量针头液滴大小，并确保每次在油中注射的体积为1至2纳升。开始此操作步骤时，根据Kimmel的标准，所有胚胎的注射时间应比目标发育阶段提前30分钟。

例如，为了研究受精后24小时的脑室，需在受精后23.5小时向胚胎注射。将处于目标发育阶段的胚胎置于体视显微镜下，用镊子小心去除胚胎的绒毛膜。接着，使用涂有1%琼脂糖的塑料培养皿制备胚胎用的琼脂糖凹槽，在琼脂糖上用一次性200微升移液器吸头戳出小孔。

使用镊子小心地将琼脂糖塞从孔中取出。将胚胎及胚胎培养基转移至带孔的琼脂糖培养皿中。向培养基中加入三卡因（Trica）以麻醉胚胎并防止其移动。

实验过程中，将胚胎尾部朝下轻轻放入孔中，并调整方向，使注射装置位于胚胎的后侧。现在胚胎已在培养皿中正确放置和定位，我们准备进行脑室注射。首先，调整显微操作装置，使针尖与高倍镜下观察的胚胎处于同一视野中。

将针头小心地穿过后脑薄层的顶板，位置位于 R 零 R 一铰接点后方，注意不要触及下方的脑组织，注入适量染料以完全充满脑室。根据胚胎的发育阶段，可能需要多次注射才能填满整个脑室空间。当胚胎完成注射并准备成像时，需为胚胎准备一个新的 aros 培养皿。

使用一个洁净的、涂有1%琼脂糖的培养皿，用工具在培养皿上打孔并取出小块琼脂。将胚胎转移至该培养皿中，并加入三卡因（trica）以麻醉胚胎并防止其移动。将已向心室注射的胚胎尾部置于孔中，调整位置以获取背侧图像。

胚胎现已准备好进行成像。使用透射光拍摄图像。在此过程中，切勿移动胚胎或显微镜，这一点至关重要。

接下来，调整显微镜的设置，使用荧光光源拍摄图像。重新定位胚胎，分别利用透射光和荧光光源拍摄侧视图像。将所有图像保存为文件，用于后续在 Photoshop 中进行图像处理。

在 Photoshop 中处理图像时，打开在同一位置拍摄的同一样本胚胎的透射光图像和荧光图像。确保每幅图像的所有设置完全相同。对于每组图像，将荧光图像拖动到透射光图像上，并在选中荧光图像的情况下将其与透射光图像精确对齐。选择“图像调整”，然后选择“替换颜色”，将黑色背景更改为白色。

在替换颜色窗口中，向右调整容差因子，直至荧光图像的颜色看起来均匀一致。在图层窗口中，选择“正片叠底”模式。为查看叠加图像，您的心室腔图像应与透射光图像完全匹配。

保存此文件，并对其他图像重复此操作。如果心室注射操作正确，图像应呈现清晰的边缘，且染料无弥散现象，如本图中受精后25小时的野生型胚胎所示：图A为明场图像，图B为荧光图像，图C为叠加图像。

图D显示了叠加图像的侧面观。另一方面，如果在心室注射过程中针头插入过深，则会进入心室腔下方的脑组织，导致注射位置错误。这将造成染料出现在心室腔外，并可见于卵黄中，如此处所示。图E显示了明场图像。

图F显示荧光图像，图G显示叠加图像。图H展示了叠加图像的侧面视图。箭头指示染料超出脑室空间的区域。在本视频中，我们演示了如何将荧光染料注射到发育中的斑马鱼脑室中。

该方法用于可视化脑室腔隙，以区别于周围的神经上皮，对于确定脑室腔隙的形态以及周围脑组织的形状极为有用。该技术使我们能够更好地理解活体胚胎发育过程中脑室形成及脑形态发生的动态过程。它是研究脑室形成缺陷以及对脑形态发生突变体进行初步表征的理想工具。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。