研究有丝分裂的显微注射技术 黑腹果蝇 合胞体胚胎

该实验步骤首先在新鲜的葡萄汁培养板上收集胚胎，时间为30至60分钟。从培养笼中取出培养板后，用湿润的毛刷拾取胚胎，并将其放置于双面胶带上。使用镊子的一半轻轻滚动一个胚胎，使其在胶带上转动，直至卵壳破裂打开。

拿起胚胎，轻轻将其放置在盖玻片上。滴加一层het胶。重复此步骤，直至获得足够数量的胚胎。

脱水后，胚胎即可进行注射。大家好，我是来自加州大学戴维斯分校分子与细胞生物学系Jonathan Sculley博士实验室的Ingrid Bruce Musher。今天我们将向您展示一种对果蝇合胞体胚胎进行显微注射的实验方法。

我们采用此方法研究微管和基于收缩环的马达蛋白在有丝分裂中的作用。例如，我们将针对特定有丝分裂蛋白的抗体或其他抑制剂进行显微注射。通过分析这些抑制剂对有丝分裂的影响，我们能够确定靶蛋白的功能。

那么，让我们开始吧。在实验开始前两到三天进行准备工作，通过在塑料瓶相对两侧各切一个约一平方厘米的小孔来设置产卵笼。在孔中塞入棉团，以允许空气流通。

将果蝇轻敲入瓶中，然后用葡萄汁平板封口。加入酵母后，将带腿的笼子置于室温下，果蝇可产卵长达10天，实验前至少一天开始产卵。抽取注射用针头并保存在4摄氏度。

实验当天，准备并装填针头。首先，将标记好的微管蛋白从冷冻箱中取出，置于冰上5至15分钟。接着，用GPEM缓冲液稀释，然后在4°C条件下以13,000转/分钟离心10至15分钟。

最后，将一到两微升样品加入进样针中，并在4°C下保存，以防止针内样品因温度变化而发生聚合。在安装盖玻片之前，通过卷起双面胶带并将其放入100毫升的瓶子中制备庚烷胶。

加入约 50 毫升庚烷，密封瓶子并摇晃数天。在准备胚胎前，先制作一个脱水室，胚胎在注射前将被放置其中。为此，将一个 35 毫米培养皿的一部分放入 100 毫米的培养皿中作为平台，在其周围加入干燥剂（无水硫酸钙），确保干燥剂的高度不超过平台，然后盖上盖子。

开始准备胚胎时，首先每隔一小时用含酵母的葡萄汁平板从湖中网箱收集胚胎，收集开始约两小时后应进行胚胎成像。准备盖玻片时，将其放置在载玻片的一侧，并用胶带固定四个角，防止移动。使用棉签在盖玻片上沿直线涂布一层正庚烷胶。

胶水不应过于黏稠，且应在几秒钟内干燥。如果胶水太稠，可加入更多庚烷进行稀释。最后，在载玻片上盖玻片旁边贴上一小段双面胶带。

用湿润的刷子轻轻滑动。小心地从葡萄汁培养基上拾取胚胎，并将其放置在载玻片的双面胶带上。接着，用镊子的一半轻轻滚动胚胎，使其在双面胶带上翻转，直至卵壳破裂打开。

轻轻将胚胎在Corian表面滚动，使其粘附在镊子上，然后将其放置在盖玻片的庚烷胶上。放置时，使胚胎的长轴与盖玻片的长边平行。将10至20个胚胎排成一行。

取下盖玻片，放入脱水室中处理三到八分钟。处理时间取决于当地湿度和待注射的样品量。随后，将盖玻片放置在涂有真空油脂的金属腔室上。

最后，用卤代烷油覆盖胚胎，以避免进一步脱水。此时胚胎已准备好进行显微注射。首先，在16倍物镜下找到胚胎。

将胚胎移开，并在不改变焦平面的情况下找到针头。将针头置于视野中央，并仅沿Z轴方向向上移动，避免在X或Y方向上移动。若需打开针头，可将盖玻片的边缘移入视野中，但不得遮挡针头所在位置。

将针头降至相同的焦平面。非常小心地移动盖玻片，直至其接触针头并轻轻将其刺破。随后将针头向上移开。

现在将胚胎移入视野中。将针头浸入油中，以确保从针头获得良好的液滴。稳定地将胚胎移向针头，向胚胎内注入一滴液体，然后将胚胎移开。

所有胚胎注射完成后，即可使用60倍或100倍物镜在共聚焦显微镜下进行观察。对照胚胎应呈现本视频中所示的形态。该胚胎表达GFP标记的微管蛋白和RFP标记的组蛋白，图像采用100倍物镜在转盘共聚焦显微镜下采集。

显示的总时间为八分钟。在对照胚胎中，极与极之间距离的曲线图具有高度可重复性，是判断实验成功与否的可靠指标。其形态应与图中第11至第13个周期所示的曲线相似。

本视频展示的是另一个对照胚胎，该胚胎表达 KLP61F-GFP 并注射了 rhodamine 标记的微管蛋白。图像同样使用转盘共聚焦显微镜配备 100 倍物镜采集，总时长为七分钟。

此视频是在显微注射后立即采集的，视频开始时可见r Domine微管蛋白浓度梯度清晰。这些胚胎可用于研究显微注射Klp 61 F抗体后Klp 61 F活性的抑制情况。我们可以观察到Klp 61 FGFP从纺锤体上的消失。

我们刚刚向您展示了如何对果蝇的切口胚胎进行显微注射。在进行该操作时，重要的是要记住设置对照组，首先练习单独注射缓冲液或芦丁，并确保有丝分裂能够正常通过细胞期。当所有注射操作均稳定可靠且不会造成损伤后，您便可注射抑制剂，并研究该特定抑制作用的效果。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。