主动脉环实验

主动脉环实验的总体目标是提供一种灵活的实验体系，通过该体系可在三维基质内由小鼠主动脉组织块诱导出新生血管。该方法首先从小鼠体内分离胸主动脉，并仔细清除残留的周围组织。将清理后的主动脉切成片，即主动脉环，然后将其分别放入48孔板的各个孔中，每孔内含有以基底膜提取物（BME）制成的圆顶状凝胶。

额外一滴BME将血管环包裹成三维结构。该基质可包含任何选定的实验试剂。孵育数天后，可观察到血管从主动脉环中出芽，从而评估待测化合物的血管生成潜力。

您好，我是来自以色列贝尔谢巴内盖夫本-古里安大学临床生物化学系 E·刘易斯博士实验室的 Karen Bein。今天我们将向您展示小鼠主动脉环实验的操作流程。在我们的实验室中，利用该方法研究各种材料对血管形成的影响。

那么我们开始吧。首先，将基质胶（basement matrix extract，BME）置于冰上或4°C条件下解冻。解冻后，需始终保持BME处于低温状态，以防止其再次凝固。

实验当天，通过标准的氯胺酮和赛拉嗪注射处死一只6至7周龄的小鼠，迅速经颈动脉放血，随后进行颈椎脱位。在无菌超净工作台中，用70%乙醇擦拭动物体表，开始操作。接着，在解剖显微镜下，使用无菌镊子和解剖剪进行皮肤的纵向切口，并打开腹膜壁。

应做切口以暴露上部胸骨，同时切断肋骨，并移除膈肌。接着小心地将所有器官完全推开，充分暴露位于脊柱旁的胸主动脉。在暴露主动脉后，将细小的无菌镊子插入主动脉与脊柱之间。将镊子张开，逐渐将主动脉从其床状结构中抬起，分离胸段主动脉与其他部分的主动脉。

现在主动脉已分离，使用锋利的剪刀从靠近肾血管的一端开始，向心脏方向剪下，将主动脉从鼠体上剪除。将切除的胸主动脉置于一个盛有冷的无菌 PBS 的培养皿中。主动脉取出后，可在体视显微镜下使用两把无菌镊子制备主动脉环。

清除胸主动脉周围的脂肪组织。注意不要损伤主动脉，仅在边缘处进行操作。在完成清理前，应反复将主动脉浸入含有 PBS 的培养皿中，以防止其脱水。

现在胸主动脉已清理干净，使用手术刀并在双目显微镜下将主动脉均匀地切成1毫米长的环状片段。切割时，将尺子置于切割平面下方作为参考，确保使用新的刀片，并定期更换以保持锋利。主动脉的两端不使用。每切下一个环状片段后，用镊子将其轻柔地转移至含有冷PBS的新培养皿中。

将所有环状组织置于同一含有 PBS 的培养板中，以确保实验的随机性。由于主动脉的每一段血管具有不同的血管生成潜力，因此需将组织环置于冰上保存。接下来，使用预冷的移液器吸头准备检测板。

在48孔板的每个孔中加入约150微升冷的BME，形成液滴，该液滴在移动过程中会凝固成圆顶状。BME可允许物质转运、细胞趋化，并且最重要的是，可促进细胞分化和迁移，从而导致新生血管的形成。周边孔中应加入PBS，以避免BME脱水。将BME液滴置于37摄氏度环境下孵育20至30分钟，使其完全凝固。BME凝固后，使用镊子小心地从培养皿中取出主动脉环；为避免损伤组织，应将主动脉环转移至镊子尖端之间由液体表面张力形成的液滴中。随后，将单个主动脉环置于每个凝固圆顶的顶部中央位置，并在37摄氏度下孵育10分钟。接着，在每个主动脉环上方再加入150微升BME，并继续在37摄氏度下孵育20至30分钟。

在 37 摄氏度下，环状结构现已被包埋于 BME 和检测体系中。可向孔板中加入材料以启动检测。对于阴性对照，需在预先准备的人源内皮细胞无血清培养基中添加实验材料；作为阳性对照，则加入内皮细胞生长补充剂。

仅使用基础培养基。向每孔中加入500微升含pres补充剂的培养基，在37摄氏度下孵育6至12天。在此孵育期间，于显微镜下观察培养板，检查是否有血管从主动脉 sprouting（出芽），并观察是否存在由进一步分支形成的高级成熟血管。

应在第6至12天期间，使用标准相差立体显微镜对环状组织进行三维延时成像。此外，在第6至12天之间的不同时间点收集上清液，于4°C保存并在一天内用于Eloqua检测，或于-20°C或-80°C保存以备后续使用。上清液可通过多种方法进行分析，例如采用Eliza法检测vgf，或通过Griess法检测一氧化氮水平。

这些图像采集于将环状物置于孔中并分别与培养物或培养基（上排图像所示）或作为血管出芽阳性对照的 ECGS 共同孵育后的第 12 天。下排图像为每种实验条件下通常使用的 12 个环中的 4 个环的代表性图像。

每个独立孔中主动脉环的角落均为黑色。以此方式拍摄时，经 ECGS 处理的主动脉环显示出血管生长，箭头所指为已形成的多条血管中的若干条。每条血管均由内皮细胞链构成，并偶见分支，表明其已成熟。

在培养物中无法观察到出芽的血管。上图中的培养孔，我们刚刚向您展示了进行主动脉环实验时的操作方法。在执行此操作时，重要的是要准确操作，并充分了解其培养条件。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。