在 Xenopus 卵母细胞中可视化 RNA 定位

在此过程中，将带有荧光标记的RNA转录本注射到XUS细胞中，并监测其定位。首先，使用荧光核苷酸对RNA进行标记。

在体外转录反应中，将RNA加载至显微注射装置中。将卵母细胞放置于注射培养皿上，并进行精确的显微注射。最后，培养卵母细胞以使RNA定位发生，随后在共聚焦显微镜下进行成像观察。

大家好，我是来自布朗大学分子生物学、细胞生物学和生物化学系 Kimberly Mallory 博士实验室的 James Gagnan。今天我们将向您展示一种在爪蟾卵母细胞中可视化亚细胞 RNA 定位的方法。我们实验室利用该方法研究脊椎动物早期发育过程中 RNA 定位所需的 RNA 结构和蛋白质因子。

那么我们开始吧。首先，按照随附的书面实验方案所述，对mRNA进行转录，并使用放射性标记和荧光标记进行标记。加入DS以降解模板DNA，然后通过添加EDTA终止反应。

通过G 50柱离心去除未掺入的核苷酸及其他小分子。然后通过乙醇沉淀浓缩RNA，洗涤并重新悬浮。通过闪烁计数测定浓度后，将RNA稀释至50纳摩尔，并分装为5微升的等份，于-80摄氏度保存。

准备进行显微注射时，取出标记好的RNA，于70摄氏度变性5分钟。然后在室温下以最大速度在微量离心机中离心10分钟，以去除颗粒物，并置于冰上保存。接下来，将非洲爪蟾卵巢组织剪成小块，放入含有25毫升浓度为3毫克/毫升的50毫升锥形管中。

在pH 7.4的0.1摩尔磷酸钾缓冲液中使用胶原酶。由于批次间差异，需在18摄氏度下轻轻振荡。胶原酶处理时间可能有所不同，应通过肉眼观察仔细监测。

为确保充分去卵泡，持续震荡15分钟，或直至卵母细胞明显从卵巢组织分离。静置，使卵母细胞沉降至锥形管底部。吸除溶液，更换为MBSH缓冲液。重复此步骤，共洗涤三次，包括本次在内总计三次洗涤。

接下来，在标准光学显微镜下手动分选第三至第四期的CYTES和MBSH缓冲液。第三期的cytes完全不透明但呈白色，而第四期的cytes略大，且带有色素斑点。

细胞若略显透明，则说明其过于年轻；而完全着色或色素分布极化的细胞则过于老化。最后，使用3.5英寸的毛细管拉制并修整针尖，制备显微注射用针头，使其外径约为0.05毫米。现在，mRNA、卵母细胞和注射针头均已准备就绪，可进行显微注射操作。

首先使用去离子水校准针头，使每次注射输送两个纳米。使用气体控制的显微注射器装载针头，并在显微镜下用千分尺校准液滴大小。校准完成后，将待注射的RNA前装载入针头中。接下来，将分选好的卵母细胞置于含有MBSH缓冲液的注射皿中，该皿底部含有一层黑色泡沫橡胶。

在黑色背景下，白色细胞清晰可见。然后，将每个卵母细胞小心地注入两微升浓度为50纳摩尔的RNA。确保每个卵母细胞仅注射一次，并在注射完成后定期检查针头是否堵塞。

推出剩余的RNA，用去离子水冲洗针头，并加载下一份RNA用于注射。注射完成后，将注射过的细胞转移至无菌24孔板中的一个孔内，最多可转移一千个细胞。每个孔中的细胞可进行培养。

吸去缓冲液，每孔加入400 µL细胞培养基。然后将培养板放入带有湿纸巾的塑料容器中，以维持培养期间的湿润环境，在18 °C下孵育卵母细胞，孵育时间根据实验需求选择8至48小时之间的时间点。注射后的卵母细胞在完成孵育后即可进行显微镜观察前的制样准备。

挑出任何已死亡的卵母细胞，并将存活的卵母细胞放入玻璃小瓶中。通常可观察到超过90%的卵母细胞存活率。用M-E-M-F-A固定液替换缓冲液，并轻轻振荡卵母细胞20分钟。

固定完成后，避免卵母细胞在光照下暴露。通过移除固定液并加入等体积的MBSH缓冲液来洗涤卵母细胞。重复此洗涤步骤一次，共洗涤两次。

接下来，将卵母细胞洗涤至无水甲醇中。首先，移除一半体积的液体，并替换为甲醇。重复此步骤两次。

完成这些洗涤步骤后，移除所有溶液，并用甲醇替代。再重复进行一次甲醇洗涤。固定并脱水的卵母细胞可在负20摄氏度下保存，直至准备成像时使用。

成像前，向 WPI 玻底荧光培养皿中加入 Marie 透明介质，使其覆盖成像表面。小心将卵母细胞从甲醇转移至荧光培养皿中，尽量减少带入的甲醇体积，在倒置共聚焦显微镜下对卵母细胞进行成像，蔡司 LSM 510 和 Aica TCS SP 均可获得良好结果。接下来展示微注射后亚细胞 RNA 定位的一些代表性图像：经过 8 小时培养后，可在细胞核中观察到荧光标记的对照 RNA。

RNA 可见均匀分布在卵母细胞的细胞质中。然而，含有能够招募运输机制序列的荧光标记 RNA 可见正在向卵母细胞的植物极进行亚细胞定位。我们刚刚向您展示了如何将荧光标记的 RNA 微注射到 zap 细胞中，并通过共聚焦显微镜观察 RNA 的定位情况。

进行此操作时，重要的是使用去RNase处理的溶液，以避免RNA污染培养物，使用含抗生素的OCM培养细胞，并尽可能避免阳光直射细胞，以防止光漂白。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。