植物细胞壁（木质纤维素生物质）的全面组成分析 第二部分：碳水化合物

测定植物细胞壁中基质多糖的组成以及结晶纤维素含量，首先从干燥的植物材料开始，经过一系列提取处理。所得材料仅包含细胞壁，随后对其进行分步分析以确定基质多糖的组成。将细胞壁材料用弱酸处理，水解非结晶性多糖（主要为半纤维素），使其降解为单糖。

随后将单糖转化为相应的挥发性醛醇乙酸酯，再通过气相色谱-质谱联用技术进行分析和定量，以测定结晶纤维素含量。细胞壁经图示试剂处理，该试剂为一种酸混合物，可去除非晶态壁组分。剩余的结晶纤维素被降解为其单体葡萄糖，可通过比色法进行测定。

另一部 JoVE 视频出版物《植物细胞壁综合组成分析，第一部分：木质素》展示了木质素含量和组成的测定方法。大家好，我是马歇龙州立大学大湖生物能源研究中心细胞壁分析平台负责人马库斯·保莱（Marcus Pauley）。我是细胞壁分析平台经理克里夫·福斯特（Cliff Foster）。

今天我们将向您展示如何测定存在于不同同型纤维素植物细胞壁材料中纤维素的多糖组成。在大湖生物能源研究中心，我们致力于开发将这些糖类转化为生物燃料的技术。为了确定最优的植物原料，我们首先需要评估这种生物质中所含糖类的种类和丰度。

在另一段名为《植物细胞壁全面组分分析，第一部分：木质素》的视频中，我们将重点介绍多酚分析。现在就开始吧。首先通过分离细胞壁来启动该实验流程。

使用5.5毫米不锈钢研磨珠，在2毫升SAR TED螺口管中粗略研磨60至70毫克干燥的植物材料。作为高通量替代方法，可使用REM研磨仪，并按照第一部分所述，采用名为eyewall的研磨与分配机器人。研磨完成后，取出不锈钢研磨珠。

继续按照第一部分及随附的书面实验方案所示，分离细胞壁并去除残留淀粉。称取2毫克DS淀粉细胞壁材料，放入2毫升离心管中。执行此操作的高通量方法是使用眼壁机器人（eyewall robot）。

机器人取一支含有研磨后植物材料的试管，并在试管底部打一个小孔。穿孔后的试管被放置在VI进样器上。一支空试管被置于天平上，并通过振动移至VI进样器下方，物料随即从上方装有样品的试管小孔中渗出，进入下方的空试管，直至达到所需物料量。

加入100微克丙酮醇作为内标。用丙酮冲洗管壁，使细胞壁材料聚集在管底，并在气流下非常温和地蒸发丙酮。接下来，进行弱酸水解。

向每个样品中小心加入 250 微升 2 摩尔的三氯乙酸（TCA）或三氟乙酸（TFA），确保无物质溅到管壁上。盖紧管盖，于加热块中 121 摄氏度孵育 90 分钟。随后将加热块及样品置于冰上冷却，并以 10,000 转/分钟离心 10 分钟。

将含有基质多糖溶解后糖类的100微升酸性上清液转移至螺口小瓶中，注意不要扰动沉淀物质。该沉淀可用于结晶纤维素测定。在蒸发装置中，用温和的气流吹扫玻璃试管，使三氟乙酸（TFA）挥发除去。

加入300微升正丙醇以去除过量酸，涡旋混匀后在25摄氏度下蒸发。重复此步骤共三次。为通过气相色谱鉴定单糖，需进行醛醇乙酸酯衍生化反应。

首先，将单糖还原为其相应的开环醛醇，然后进行乙酰化。有关详细说明，请参阅随附的书面实验方案。该操作流程的每一步均遵循前述方案，依次加入试剂、孵育、在气流下蒸发，随后通过多种洗涤步骤去除过量试剂。

最后步骤中，提取醛醇乙酸酯。首先，加入 500 微升乙酸乙酯并轻轻涡旋。然后加入 2 毫升水，盖紧管盖后涡旋混合，以 2000 转/分钟离心 5 分钟，得到清晰的分层：上层为含有醛醇乙酸酯的乙酸乙酯相，下层为水相。用移液器吸取 50 微升乙酸乙酯层至含内插管的 GC-MS 小瓶中，再加入 100 微升丙酮稀释。GC 小瓶可于 4 摄氏度保存。

如果气相色谱-质谱（GCMS）分析不能立即进行，则需将样品注入配备四极杆质谱仪的气相色谱仪中。有关色谱柱及运行参数的详细信息，请参考随附的书面实验方案。测定结晶纤维素含量的起始材料可以是分离得到的细胞壁材料，也可以是经弱酸三氟乙酸（TFA）处理后的壁材料，后者可在酸处理后立即使用，或以可储存的干燥形式使用。

如前所述，使用异丙醇去除过量三氟乙酸（TFA）后，向两个M萨氏管中的TFA沉淀中加入1 M的去垢剂溶液1 mL，该溶液由乙酸、硝酸和水配制而成，添加体积比为8:1至2:1。盖紧管盖，涡旋混匀，并在100摄氏度的加热块中加热30分钟。经此处理后，仅有结晶纤维素保留在沉淀中。

将所有其他多糖样品在冰上或更低温度下冷却，待其升至室温或更冷后进行水解。随后将样品在10,000 RPM条件下离心15分钟，离心后弃去上清液，注意不要扰动沉淀，确保沉淀物未被移除。为此，每管中保留约150微升上清液，并用水反复洗涤沉淀数次。

接下来，使用浓硫酸进行同酸水解，以将晶体和纤维素沉淀完全水解为葡萄糖。首先，向萨尔塔管中加入175微升72%的硫酸，并在室温下孵育30分钟。初始孵育结束后，涡旋混匀样品，再继续孵育15分钟。

然后加入825 µL水，涡旋混匀，并以10,000 RPM离心样品5分钟。离心后，试管中可能残留一些呈棕色的可溶性物质，主要为木质素，而葡萄糖则存在于上清液中。使用比色蒽酮法测定上清液中的葡萄糖含量。

该实验在96孔聚苯乙烯微孔板中进行。按照随附书面方案中的说明，以复孔方式建立葡萄糖标准曲线。取每份样品上清液10微升，分别与90微升水混合，加入同一微孔板的不同孔中，随后每孔加入200微升新鲜配制的试剂，完成样品的制备。

接下来，将酶标板置于烘箱中，使用铝制导热板，在 80 摄氏度下加热 30 分钟。加热完成后，观察到含葡萄糖的样品颜色由黄色变为蓝绿色。待酶标板冷却至室温后，充分振荡混匀。

使用微孔板读数仪在625纳米处读取吸光度。葡萄糖（纤维素的基本组成单元）的含量根据与同一块板上建立的标准曲线比较后的吸光值进行计算。以下是杨木样品多糖分析的一些代表性结果。

通过标准品的质量谱图和/或保留时间来鉴定气相色谱图中的峰。单糖的定量基于标准曲线。基质多糖的糖分析显示木糖含量丰富，代表半纤维素木聚糖，但也存在其他糖类。

根据分析，杨树材料中有40%为结晶纤维素。请注意，这些含量和组分在不同植物之间或同一植物的不同解剖结构之间可能存在差异。我们刚刚向您展示了如何测定木质纤维素生物质的多糖含量及其组分，以用于多酚木质素的分析。

敬请关注第一部分。感谢观看，祝您的实验顺利成功。