小鼠胰岛分离与肾包膜下移植方法

胰岛移植已被提出作为治疗1型糖尿病的一种潜在方法。然而，两大主要限制因素阻碍了其成为广泛应用的临床现实。首先，每位受体需要大量的胰岛。

由于胰岛来源于器官捐献者，潜在受体的数量受到严重限制。二次移植需要终身使用强效免疫抑制剂，使患者（尤其是儿科人群）面临恶性肿瘤、感染和肾功能衰竭的风险。通过在小鼠肾包膜下进行胰岛移植，以研究改善临床移植效果的策略。

将来自健康供体小鼠的胰岛分离后分组并制备用于移植。随后将胰岛移植到受体小鼠肾脏的肾包膜下腔隙中。在糖尿病受体小鼠中，通过监测血糖水平来评估胰岛移植物的功能，结果表明，大约250至350个胰岛可在移植后24小时内使一只20克重的受体小鼠恢复正常的血糖水平。

该方法的可视化演示对于插管步骤至关重要。胆总管的插管以及将套管转移至肾脏包膜下间隙的操作较难掌握，这些步骤需要准确识别组织结构、稳定的手法以及采用尽量减少组织损伤的技术。

将已处死的小鼠仰卧置于解剖显微镜下的纸巾上，并用70%乙醇喷洒腹部。使用剪刀从耻骨区域向前肢做V形切口以打开腹腔。小鼠位于解剖显微镜下方。

将其放置，使头部朝向观察者。使用止血钳夹住胆总管进入十二指肠的位置，即胆总管在十二指肠的开口处。止血钳的位置应调整至当其夹紧时，恰好沿胰腺与肠交界处走行。

这里将演示两种胆管插管方法：徒手插管法和镊子辅助插管法。采用徒手插管法时，将止血钳夹住的十二指肠从鼠体头部向尾部方向牵拉，使胆总管绷紧。

在靠近肝脏的胆管处有一个汇合点，来自胆囊的胆汁和来自肝脏的酶在此汇合。在进入肠道之前，拉紧胆管以暴露V形位置的内部。将一根连接5毫升注射器的弯曲27号针头插入，使针头穿过V形区域，直接插入胆管的下部。将针头向前推进数毫米，超过斜面末端，以防止液体反流至肝脏和胆囊。

一旦插管成功，从注射器中注入两毫升胶原酶溶液以灌注胰腺。观察胰腺在胃部上方的膨胀情况，以判断插管是否到位。此外，也可选择插管胆管。

采用镊子囊法。将夹住十二指肠的止血钳C从鼠体头部方向朝尾部方向拉开，使胆总管绷紧。然后使用连接在5毫升注射器上的弯头27号针头，在靠近肝脏处的胆总管下方穿刺筋膜。

用针头在针仍处于原位的情况下清除导管周围的筋膜。放下止血钳，取一把镊子。用张开的镊子的一臂支撑针头已清除筋膜的胆管部位，同时将导管和镊子向前牵拉。

使用镊子作为支点，将针头插入导管。成功的插管表现为胃上方胰腺区域均匀膨胀。一旦胰腺完成灌注，即从十二指肠上移除止血钳。

然后用镊子提起十二指肠，并用另一把镊子将胰腺与肠道分离。接着，将胰腺从胃的上部和脾脏处轻轻拉离。最后，将胰腺从腹腔中提起，并切断其与肠道、胃和脾脏之间残留的筋膜连接。

将胰腺置于一个50毫升的锥形管中，并放在冰上。根据随附书面方案中的说明，在37摄氏度下孵育胰腺。孵育后，向管中加入20毫升培养基，并通过在10秒内剧烈振荡管子40次来解离组织。

此步骤对于紫罗兰细胞的最佳回收至关重要。以每分钟800转的速度离心细胞。在15毫升培养基中重悬细胞，并浓缩样品。

将重悬的悬液通过0.419毫米的金属筛网，并倒入一个新的50毫升锥形管中。用额外10毫升含有10%胎牛血清的培养基冲洗第一个管子，并将冲洗液通过金属筛网。通过离心沉淀细胞，重悬后，用5毫升室温的His opaque 10 77重悬沉淀。轻轻涡旋数秒，沿管内壁加入额外5毫升His opaque，以冲洗附着在管壁上的细胞。然后缓慢移液，以每10秒1毫升的速度沿管壁叠加10毫升无血清RPMI培养基。

应可见清晰的界面。随后将样品置于水平转子离心机中，在20摄氏度下以900 × g离心20分钟，离心过程中加速度需极慢，离心结束后不进行刹车。使用一次性10毫升血清移液管将胰岛与外分泌细胞分离。将胰岛从Histopaque介质界面转移至新的50毫升锥形管中。

此时可将多个管中的样品合并，以去除眼状结构残留物，用含血清的培养基填充这些不透明的管，并在800转/分钟条件下离心2分钟，使胰岛沉淀。然后将胰岛重新悬浮于新鲜培养基中。重复此步骤至少两次。

将细胞团块悬浮于5 mL培养基中。将0.1毫米尼龙细胞滤网倒置放在15 mL锥形管上。用移液器将重悬的细胞悬液通过滤网，以收集眼状结构。

然后用额外的6毫升培养基冲洗50毫升离心管，并将液体通过滤网。在10厘米的培养皿中加入3毫升培养基。将细胞滤网倒置，浸入培养基液滴中以收集筛孔中的细胞，再通过滤网向培养皿中加入额外的5至7毫升培养基。

在4倍物镜下收集滤网中剩余的胰岛时，使用P200移液器逐个挑取胰岛，并转移至1.5毫升微量离心管中。这些图像显示的是从12周龄C57BL/6小鼠中分离得到的胰岛。胰岛的纯度和质量可在分离程序完成后通过显微镜进行评估。

例如，此处显示的两张图像展示了一个存在碎片和外分泌细胞污染的代表性视野。在为实验挑选胰岛时，应避免挑选任何被污染的外分泌细胞或外观不健康的胰岛。如本图所示，在分离后24小时可观察到具有坏死中心的胰岛属于不健康状态，但在刚分离后坏死中心尚不可见。

在这一持续24小时的眼状结构延时视频中，脱落的细胞眼状结构不可避免，但仍可用于眼状结构移植。在分离后不久，许多眼状结构内部即出现坏死中心。这些坏死中心似乎在记录接近结束、挑选眼状结构时被从眼状结构中排出。

将它们分组，使每个试管中的环状结构在质量和大小上分布均匀。例如，每组15个环状结构可包含4个大尺寸环状结构、6个中等尺寸环状结构和5个小尺寸环状结构。将试管置于冰上，环状结构可立即用于移植或进一步操作。

使用前，将一个无菌的凝胶上样吸头插入1.5毫升微型离心管的管口，使其形成轻柔的弯曲，从而使吸头的窄端呈U形。吸头的两个开口均应朝上，正对微型离心管管口上方。

从冰上轻轻取下装有眼环的离心管。确保所有眼环均已沉降至管底。使用P200移液器从管底以最小体积轻柔吸取眼环，并转移至预处理的弯头尖端。

待小孔沉淀后，将凝胶加样枪头的大口端对准小孔，用连接P200移液器的新鲜凝胶加样枪头通过抽吸尽可能去除尖端的培养基。将导管的非斜面端连接至携带胰岛的凝胶加样枪头的窄口端，然后将枪头装到P200移液器上，轻柔地将胰岛推入导管中。

接下来，将PE 50导管的非斜面边缘连接至25微升Hamilton注射器的针头上。将推杆向外拉出，然后推动注射器推杆，直至毛细管末端距离导管斜面开口约0.5厘米处。将注射器放置一旁，使毛细管末端在准备肾脏以接收毛细管的同时，逐渐聚集形成靠近导管斜面开口处的单一团块。

通过剪除毛发并用聚维酮碘与70%异丙醇交替擦拭皮肤三次来准备手术部位。通过脚趾捏压以确认受体小鼠的麻醉效果，开始眼环移植手术。将玻璃棒的杆部直接置于小鼠下方、肾脏下方，且垂直于脊髓。

然后通过皮肤定位肾脏，并铺上无菌手术巾。找到肾脏后，使用McFerson弯剪在皮肤上垂直于脊髓方向、正对肾脏上方做一切口，长度为2厘米。该切口将使剪刀暴露腹膜壁。

使用玻璃棒的杆部作为支撑，在腹膜壁上做一个与皮肤层切口方向相同的1厘米切口，通过按压邻近表面将肾脏从腹膜开口处推出。用浸有冰冷无菌PBS的棉签擦拭暴露的肾脏表面。根据需要每隔几分钟重复此步骤，以防止肾包膜干燥。

使用27号针头，在肾脏前表面的肾包膜上做一个0.2厘米的切口。从左侧外侧向右侧外侧方向，插入一根火焰拉制的玻璃毛细管。通过先前制作的切口探入，并沿肾脏背外侧表面向后方移动。

为了在肾包膜与肾实质之间创建一个囊袋，将已准备好的25毫升Hamilton注射器上的侧孔移至柔性管斜面开口的最边缘。然后将斜面朝上插入肾包膜下囊袋中，长边与肾实质接触。

将导管移至囊膜最靠后的位置。然后通过按压注射器的推杆，缓慢地将套管从PE 50导管转移至囊下间隙。随着套管逐渐填满囊下间隙，缓慢向外退出柔性导管以腾出更多空间。

从囊袋中取出管子后，将玻璃探针沿肾脏外表面从前向后滑动，轻轻将小孔压入囊袋的近端。使用弯头镊子提起为肾脏开口处相邻的腹膜层。然后用PBS浸湿的棉签轻轻将肾脏推回腹膜腔内。

通过缝合腹膜壁并在真皮层使用伤口夹来关闭小鼠切口。将小鼠放回笼中并进行监测。恢复期间，应为小鼠肠道提供乙酰甲喹水。

分离的小鼠胰岛。采用本视频所述方法，将治疗剂量的胰岛移植到同种异体C57BL/6小鼠体内。从术后第一天开始监测非空腹血糖水平。

在接受了来自同基因供体的150个或300个胰岛团的受体小鼠中，未观察到排斥反应，因为这些胰岛团来源于同基因供体。而在接受来自异基因供体300个胰岛团的20克重受体小鼠中，大约在第17天出现排斥现象。

移植后立即检测眼状体的给药剂量，可衡量眼状体的主要功能。移植150个眼状体时仅观察到边缘性恢复，而移植300个眼状体时则观察到完全恢复。观看本视频后，您应充分理解分离小鼠眼状体并将其移植至肾包膜下间隙所需关键步骤的操作方法。

通过练习，您将能够快速掌握胆总管插管技术，这是本方案中最困难的步骤。