使用螯虾后肠进行生理学实验：一项学生实验室练习

本报告的总体目标是作为生理学课程中参与生理实验的高中高年级学生和本科生的教学工具。学生将学习如何暴露并记录小龙虾后肠的收缩活动。进一步的操作是将后肠从动物体内分离出来，以便直接施加化合物。

接下来，在施加各种药理学试剂以研究改变收缩强度的机制时，监测后肠平滑肌收缩的力度和节律。通过药理学检测和受体亚型分型，获得结果显示了调节剂作用于神经支配或直接作用于肌肉的效果。您好，我是布鲁克大学生物科学系的 Dr. J Mercier。

我一直在使用螯虾后肠作为研究控制内脏肌肉的神经递质的实验模型。我也将该模型用作教学工具，并与肯塔基大学Robin Cooper博士的实验室合作，共同优化一系列由学生操作的实验，用于教学目的。该方法有助于深入了解螯虾后肠的功能。

它还可应用于涉及蠕动节律相关疾病的研究。也可用于描述肌肉调节及神经支配机制的基础原理。学生将通过使用药理学试剂、神经递质和神经激素来学习解读生理学和药理学数据，并获得关于受体功能的总体理解。

关于激动剂和拮抗剂，学生将构建剂量-反应曲线，并以图形形式呈现数据以进行统计分析。为麻醉动物，将一只体长为6至10厘米的螯虾置于冰上5至10分钟。用一只手从螯的后方握住已麻醉的螯虾。迅速从两侧的眼窝向头部中央切割，然后将螯虾去头。

制备过程中血液会具有黏性，因此操作完成后应及时清洗工具。接下来，切除腿部和螯足，然后切除左右尾鳍，保留中间尾鳍，并沿腹部背侧一直切至最后一节。

然后沿最后一节段切开，并沿另一侧向下切开，取下背壳。将解剖好的小龙虾放入铺有锡纸的培养皿中。

使用效果较差的螯虾生理盐水。用解剖针将制备好的标本固定在培养皿中以固定标本。后肠通常被大量血管和结缔组织包围。

用镊子将其移除，注意不要损伤肠道。此时后肠已沿腹部清晰可见。

将解剖好的螯虾标本置于生理盐水中静置约10分钟，使其从解剖和生理盐水暴露造成的休克中恢复。观察后肠缓慢的蠕动性收缩。随后即可开始计算收缩频率。

记录30秒内发生的收缩次数，并将其记入日志。同时记录发生的收缩类型，以及其为蠕动性还是痉挛性收缩。注意任何蠕动波的传播方向。

计数靠近肛门处以及腹部中段的收缩频率，观察这两个区域之间是否存在频率差异。准备多种测试溶液，并将其温度调节至与灌流生理盐水相同。此处首先测试的溶液为用螯虾生理盐水配制的1微摩尔血清素溶液。

使用移液器将螯虾暴露腹部体腔内的生理盐水吸除，并直接将1 µM的5-羟色胺溶液施加到后肠。加入新溶液后立即等待30秒，然后计数肛门附近区域30秒内的收缩次数，接着计数腹部中段接下来30秒内的收缩次数。将这些数值记录在表格中，并同时记录所发生的收缩类型。下一步。

将记录皿中的测试溶液倒出，用正常的螯虾生理盐水冲洗后肠数次。随后每30秒冲洗一次制备样本，持续五分钟。此时，可加入下一种测试溶液，本演示中为1微摩尔的Topamine。

按照之前的方法记录您的观察结果，并对剩余的待测化合物重复此过程。当使用同一物质的不同浓度时，务必从最低浓度开始，逐步进行至较高浓度。用于测量胃肠道收缩力的装置包括一台安装有 LabChart 7 软件的笔记本电脑、Bridge Pod、PowerLab 26T 以及力传感器。

在测量胃肠道肌肉收缩力之前，需要先分离胃肠道。为此，剪除腹部最后一节的肌肉，将两枚或更多的针穿过肛门两侧柔软的腹侧表皮，然后切除其余的腹部组织，仅保留后肠和肛门连接一小块表皮。肠道的切断位置应靠近胸部与腹部的交界处。

现在将胃肠道移至底部涂有沙丁鱼油的浅皿中。胃肠道背侧有一条血管，需小心将其从胃肠道上剥离。

将新鲜的螯虾生理盐水倒入标本中。移动力传感器至标本处。仔细观察粘在力传感器底部的针。

连接肠道的一端带有一个小弯钩。将针的小弯钩勾住后肠的切断端。勾住后肠后，轻轻移动培养皿，直至后肠绷紧。

进行此步骤时需小心，肠道应保持紧绷，但不可过紧。过紧可能会损伤肌肉。当培养皿处于最佳位置时，使用石蜡或黏土固定培养皿以保持稳定。

接下来，启动软件。开始记录前，请打开实验室图表软件。关闭实验室图表和欢迎中心。

前往左上角的设置。点击左下角的通道设置。将通道设置更改为仅保留一个通道。

点击屏幕右侧的“确定”。进入通道一的桥接舱。将量程设置为最敏感的档位，即右上角图表顶部的 200 微伏。

将每秒循环次数设置为2K。现在可以开始记录。点击“开始”以确保设备正常工作。

用移液器轻轻触碰换能器的探头。你应该能看到软件记录到的力值发生变化。在软件中点击停止，然后点击开始，让程序继续运行。

持续约20秒，点击停止并添加一个标记为生理盐水的注释。仅通过测量一次偏转开始到下一次偏转开始之间的时间，或通过计算一分钟或两分钟内的总偏转次数，来计算收缩频率。根据收缩发生的快慢，以每分钟收缩次数或每秒收缩次数为单位计算频率。

为了测量收缩力，使用相对测量方法在已保存的文件上比较不同条件下的收缩情况。将标记 M 移动到基线，然后将光标移至偏转波形的峰值处，并记录屏幕右上角显示的数值。该数值为 delta 值，表示从 M 点到峰值的差值。

请注意，必须将光标固定在波峰处以测量其变化。然后将 M 标记和光标移至下一个感兴趣的波形，并重复测量以观察调节剂的作用。在此制备过程中，缓慢将灌流液切换为待测溶液。

在此情况下，加入一微摩尔的5-羟色胺，并继续记录收缩频率和收缩力度，作为最后一次测试。通过该实验准备，检测缝隙连接抑制剂是否改变收缩的频率或力度，缝隙连接抑制剂包括己醇或经二氧化碳鼓泡的生理盐水。这些化合物应在最后使用，因为长时间暴露可能损伤肌纤维。为比较各种化合物的作用效果，将数据绘制成图表。

该制备方法的另一个有趣用途是记录环形肌产生的力。然而，如果你已在制备过程中应用了缝隙连接抑制剂，则这些抑制剂可能已损伤环形肌；在此情况下，应使用新鲜的后肠制备样本以检测环形肌功能。为暴露环形肌，需使用精细剪刀沿肠管的纵轴方向剪开肠壁。

使用细针将条带的一侧牢固地固定在培养皿上。将换能器上的带钩针连接到条带的另一侧。对制备的标本施加与纵向肌实验中相同的化合物，此处显示了所测试化合物与收缩次数及类型之间的关系。

可以绘制生理盐水、5-羟色胺和谷氨酸溶液中收缩次数随时间变化的曲线图。还可以绘制生理盐水、5-羟色胺和谷氨酸溶液中收缩次数与收缩力度（以毫伏为单位）的关系图。这些作图可分别针对纵行肌和环形肌进行，以检测肠道不同区域的纵行肌和环形肌对各种调节因子的反应是否存在差异。

上述实验可在从肛门向上沿腹部的不同区域重复进行。在进行该操作时，需注意使用镊子时应小心谨慎，避免损伤胃肠道，并注意使用力传感器时不要施加过大的拉力。在此操作之后，还可采用其他方法，如对肌肉进行电生理记录，以研究其他问题，例如离子通道的功能与调控，并可作为其他动物模型中其他组织的研究模型。