收集变浓度等温滴定量热法数据集以确定结合机制

本实验的总体目标是确定描述大分子与其配体结合的正确物理模型，并测定相关的热力学参数。首先通过充分透析制备大分子的储备溶液，然后将目标配体溶解于最终的透析缓冲液中，并在第二步中测定所有组分的浓度。

将大分子和配体样品小心地稀释至一系列不同浓度。接下来，在多种配体和蛋白质浓度条件下进行一系列等温滴定 calorimetry（ITC）实验，以在该实验流程的最后一步获得一系列 ITC 等温曲线。对这一系列实验数据采用不同的物理模型进行全局分析，并确定能提供最佳整体拟合效果的模型为正确模型。

今天我将向您展示一种方法，该方法可用于解答生物物理学问题，例如蛋白质分子如何与其配体结合，并可准确测定结合参数，如焓变、熵变和结合常数。在开始本实验方案之前，需纯化目标蛋白质。本演示中所用的大分子为免疫糖苷N-六磷酸，一种转移酶SIX Prime A或C六磷酸A I。首先，配制四升透析缓冲液并冷却至四摄氏度。接下来，对少量大分子溶液进行透析。

在此情况下，将5毫升400微摩尔的AAC C六 prime，一 eye 溶于1.3升透析缓冲液中，在4摄氏度条件下进行透析。可在冷室或冰箱中操作，每8小时更换一次新鲜缓冲液，总共透析三次。保留最终的透析液。

将750毫升终末透析液通过0.45微米纤维素滤膜过滤，并于4摄氏度保存。此缓冲液现称为运行缓冲液，将用于洗涤及作为稀释剂。对于样品，需用运行缓冲液充分冲洗0.2微米注射器滤膜。

加入蛋白样品并过滤。在储存蛋白溶液之前，用锥形管轻轻收集样品，并使用标准蛋白检测方法测定蛋白浓度。本实验中，蛋白浓度通过在280纳米处的吸光度（ABSORBENCE）测定，并据此计算酶浓度。

使用来自 EXI 蛋白质组学服务器生成的消光系数，以最大化长期稳定性的方法储存蛋白质。AAC C six prime one eye 必须在 4 摄氏度下保存，因为其在冻融后无法保持活性。接下来溶解配体和运行缓冲液。本演示中，将 4 毫克乙酰辅酶 A 溶解于 200 微升运行缓冲液中，配制成 25 毫摩尔的储备溶液。

该配体可在使用前储存在零下78摄氏度，用于制备ITC样品。首先，根据AAC六撇一I的书面实验方案，计算酶的浓度，以获得C值为64，这对应于192微摩尔的浓度。在此浓度下配制2毫升的大分子溶液，用过滤后的运行缓冲液稀释原液。将乙酰辅酶A溶液在冰水浴中解冻。待乙酰辅酶A溶液完全解冻后，轻轻混匀，通过将大分子浓度乘以结合位点数再乘以10，计算配体溶液的浓度。

通过将80微升25毫摩尔的乙酰辅酶A储备液加入420微升运行缓冲液中并混匀，配制乙酰辅酶A溶液。将稀释后的乙酰辅酶A溶液转移至移液管填充管中，并将剩余的25毫摩尔储备液于-78摄氏度保存。在19摄氏度（比预定实验运行温度低1摄氏度）条件下，对AC6'1I和辅酶A溶液进行真空脱气5分钟。

安装注射器时，将注射器穿过注射器支架，直至预装的注射器夹与支架处于同一高度。将第二个注射器夹套在注射针筒上，直至其紧贴支架底部。使用提供的 0.05 英寸球头六角扳手轻轻拧紧夹具。

接下来，将注射器架放入移液器架中。轻轻将移液注射器滑入注射针筒内，并确保推杆尖端直接插入针筒的孔中。完全插入后，将注射器架的锁紧环拧入移液注射器中。

在上样A a C six prime one eye蛋白样品溶液之前，使用仪器配备的细胞清洗系统，用至少50毫升的运行缓冲液清洗样品池。用一支长针头2.5毫升玻璃注射器抽吸，去除样品池中残留的缓冲液。使用第二支洁净干燥的长针头，从脱气真空装置中移除溶液。

2.5 毫升注射器。小心吸取至少 1.8 毫升的 A a C six prime one eye 蛋白样品至注射器中。注意避免产生气泡。

将蛋白样品加入注射器后，将针头插入样品池并轻轻接触池底。然后将针头向上提起约一毫米，缓慢向池中注入样品，直至样品液面高出样品池顶部并可见液体溢出。为排除池中可能存在的气泡，将针头向上提升约一厘米，同时确保溢出部分仍保持液体存在，随后迅速抽出并重新注入约0.25毫升溶液。

现在轻轻地将针头沿溢流侧壁向上滑动。在样品孔中，针头会碰到一个凸起的台阶。将此台阶上方的所有液体吸出，因为该台阶指示了运行溶液所需的液面高度。

为装载注射器，将塑料管膨胀注射器连接到填充口，并将活塞末端降至填充口顶部。然后将DGA配体溶液的移液管填充管置于移液管架底部。检查注射器尖端未接触填充管底部，缓慢将溶液吸入注射器，直至有少量溶液进入装载注射器的管中。

接下来，通过降低活塞头来关闭填充口。此操作可通过点击“关闭填充口”按钮完成。然后去除在加载过程中可能被困住的任何气泡。

单击排空-填充按钮进行排空和填充。总共执行三次排空和填充操作。排空-填充过程完成后，从移液器支架上取下填充管，并用实验室纸巾轻轻擦拭注射器尖端。

现在将移液器组件的注射器缓慢插入样品中。操作时需小心谨慎，动作要缓慢，因为针头容易弯曲。通过按压锁定卡箍底部，确保注射器完全插入。

固定好注射器后，设定所需的运行温度，并选择略高于预期最大注射热流的参比功率。本示例中，运行温度和参比功率分别设为 20 摄氏度和 20 微卡每秒。然后设定所需的注射体积和延迟时间。

此处使用28次进样，第一次进样体积为2微升，延迟时间为62秒，后续进样体积为10微升，延迟时间为332秒。本实验演示了在单一浓度下生成数据集的基础方法，以获得生成额外曲线所需的数据。通过逐步降低大分子和配体浓度重复此过程。

务必确保所有大分子和配体样品均来自同一母液，以尽量减少浓度误差。图中显示的是将3.86毫摩尔的配体乙酰辅酶A滴定至192微摩尔的小分子AAC6'1中所获得的原始等温滴定热量测定曲线。

采用双位点连续结合模型，利用眼（Eye）的积分值确定结合参数。该图展示了通过等温滴定量热法（ITC）测定不同浓度的ACE辅酶A与AAC C六号引物一（Six Prime One Eye）所产生的等温结合曲线。以空心圆圈表示的实验数据同时拟合了双独立结合位点模型和双位点连续结合模型。

与双位点顺序模型相比，结果吻合得更好。所使用的蛋白质浓度在随文文本中已作定义。进行此操作时，务必精确进行稀释，因为浓度的变化可能对实验结果产生显著影响。