利用基因编码钙传感器监测细胞凋亡过程中线粒体钙水平的动态变化

本实验的总体目标是监测活细胞中线粒体钙离子浓度的变化。首先将钙离子指示蛋白比率型探针Peram转染至细胞中，并靶向定位到线粒体基质，转染后一至两天进行观察。随后设置荧光显微镜及软件以进行活细胞成像。

加入钙动员激动剂后，采集表达比率型钙指示蛋白的细胞的荧光图像。该实验流程的最后一步是对所获得的图像进行定量分析。最终，可通过表达比率型钙指示蛋白的活细胞荧光显微镜成像，获得线粒体钙浓度动态变化的结果。

与现有方法（如使用合成钙指示剂测量钙水平）相比，该技术的主要优势在于，比率型Peram蛋白是基因编码的，因此可靶向定位于线粒体或任何其他感兴趣的细胞器。大家好，我是阿斯卡博士（Dr. Ascar），来自本宁博士（Dr. Benning）实验室的一名博士后，今天将由我演示该实验流程。在开始实验前一晚，需将HELO细胞接种于放置在标准六孔培养板中的无菌玻璃盖玻片上，接种密度应使次日转染时细胞融合度约为70%。次日，按照生产商说明书配制DNA-Lipectamine 2000复合物，每孔转染使用4微克（µg）的线粒体定位Peram表达载体和10微升（µL）Lipectamine 2000，溶于0.5毫升（mL）Opti-MEM培养基中。

接下来，将每个孔中的 D-M-E-M-F-B-S HELOC 培养基更换为 1.5 毫升不含抗生素的相同培养基。将 LIPECTOMY 溶液加入 DNA 溶液中，待复合物形成后轻轻混匀。将 DNA-LIPECTOMY 溶液逐滴加入待转染的各孔中，轻轻摇动培养板使其混合，随后在 37 摄氏度、5% 二氧化碳的细胞培养箱中孵育 4 小时。

更换为含有抗生素的D-M-E-M-F-B-S培养基。使用镊子成像前，让细胞表达metric peram一天至两天。将载有HELOC细胞的盖玻片轻轻放入含有成像溶液的适当成像腔室中。

将成像室安装在倒置显微镜载物台上。接着，使用40倍或更高倍数的油浸物镜，并选择380纳米的激发波长。为寻找包含一个或多个表达比率型钙探针Peram的细胞区域，此处采用380纳米波长来识别这些细胞为比率型细胞。

在此波长下，Peram 对光漂白的抗性较弱。确定感兴趣区域后，将软件设置为在 495 和 380 纳米处进行双激发。接下来，通过交替在 495 和 380 纳米处激发，依次采集图像。

在施加激动剂之前，至少采集30秒的基础钙水平图像。然后通过灌流装置施加钙动员激动剂，并记录每种激动剂的添加时间。应优化激动剂暴露时间和图像采集间隔，以防止光漂白，同时保证足够的时间分辨率。实验完成后，可对图像进行离线分析。

开始分析时，如有必要，可在视野的空白区域选择一个感兴趣区域，以扣除背景荧光。接着，将感兴趣区域的495/380比率测量值导出至Excel或类似的绘图软件。该组图像显示了比率测定法检测的Peram蛋白与线粒体的亚细胞定位情况。

左侧是表达比率型pH探针的Helo细胞的活细胞图像。中间是线粒体的荧光染色图，使用了选择性染料MIT tracker red CMX Ros。最后，右侧显示的融合图像是四个在线粒体中表达比率型pH探针的Helo细胞在经10 µM ATP处理后，生成的一系列伪彩色495/380纳米比率图像；而此处所示的另一个在线粒体中表达比率型pH探针的Hela细胞图像，则展示了前述四个细胞线粒体钙离子水平变化的定量结果。

在使用0.5微摩尔浓度的storsporin处理60分钟后，单个线粒体的钙反应表现出异质性，同时线粒体出现显著的碎片化。一些线粒体显示出钙水平的振荡性升高（白色箭头所示），而另一些则未显示出明显的钙水平变化（黄色箭头所示）。该图显示了在0.5微摩尔浓度的storsporin诱导凋亡120分钟后，单个HELO细胞中线粒体总体钙水平的变化。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用选择性靶向线粒体基质的钙离子结合蛋白R-geometricin，来检测线粒体钙离子水平在不同刺激下的动态变化。