通过ELISA检测天然完整核小体上的翻译后修饰

本实验的总体目标是准确测定从一百万个细胞中提取的全细胞核小体样品内翻译后修饰的相对水平。首先需要制备高质量且均一的哺乳动物细胞培养物，随后通过Dounce匀浆器进行机械破碎并结合离心方法，从细胞中分离细胞核。

下一步是通过消化细胞核内的染色质并进行一系列低渗提取，以获得完整的核小体。最后，使用适当的对照通过ELIZA检测分析核小体，以鉴定特定的翻译后修饰。最终可获得结果，显示核小体样品中特定修饰的相对水平。

与现有的蛋白质印迹法和染色质免疫沉淀法相比，该技术的主要优势在于能够快速获得多种核小体修饰状态的整体图景。该方法比蛋白质印迹法更灵敏、更准确，并且可在大多数具备常规分子生物学实验条件的实验室中进行。该方法有助于回答干细胞和表观遗传学领域的关键问题，例如在主要的分化和重编程事件发生时会发生什么变化。

开始实验操作时，首先用每15厘米培养皿3毫升胰蛋白酶对细胞进行消化，以获得新鲜消化的细胞。加入20毫升预冷的PBS丁酸盐溶液，将细胞转移至50毫升锥形管中，在1000 RPM条件下离心5分钟以收集细胞。吸除上清液后，加入10毫升预冷的PBS丁酸盐溶液重悬细胞，再次在1000 RPM条件下离心5分钟。

弃去上清液，将细胞沉淀重悬于4 mL含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，具体操作如书面实验方案所述。接着，用移液器将细胞转移至冰上预冷的Dounce匀浆器（B型杵）中，上下吹打20次进行匀浆。然后将匀浆液转移至冰上的离心管中。

在 2000 G 条件下离心样品 10 分钟，温度为 4 摄氏度。弃去上清液，上清液中含有胞质成分和 resus。

将沉淀物重悬于2 mL预冷的含蛋白酶抑制剂的洗涤缓冲液C中，轻轻将重悬后的样品铺加到一根预冷离心管中5 mL、30%蔗糖垫上。为分离细胞核，在摆桶转子中以2,400 ×g离心5分钟，细胞核将穿过蔗糖垫，而细胞碎片则留在界面处。离心后，小心移除所有液体体积，并将细胞核重悬于250 µL预冷的含蛋白酶抑制剂的洗涤缓冲液C中，然后将细胞核转移至1.5 mL微量离心管中。

开始分离核小体时，向细胞核中加入3 µL 0.1 M氯化钙，置于37 °C金属浴中，直至温度平衡。随后在10 µL微球菌核酸酶缓冲液中加入2单位微球菌核酸酶，混匀后于37 °C孵育12分钟。孵育过程中需频繁使用移液器吸头混匀。

孵育结束后，加入6微升0.5摩尔的pH 8.0 EDTA钠盐终止反应，并将样品置于冰上冷却。随后在2000 ×g离心4分钟，离心后弃去上清液，将沉淀物重悬于300微升0.2毫摩尔的EDTA钠盐溶液中，冰上孵育1小时，期间轻轻吹打混匀数次。

在4°C条件下，以3000 G离心4分钟后，收集上清液，其中含有游离核小体，转移至新的离心管中，并置于冰上保存，以谨慎重复利用额外的核小体。将沉淀物重悬于300微升0.2毫摩尔的EDTA钠溶液中，操作同前，并在冰上孵育1小时，期间偶尔轻柔混匀。

孵育结束后，离心样品。再次将所得上清液与冰上微量离心管中剩余的样品混合。开始进行核小体ELISA实验时，向96孔ELISA板中加入一系列五次两倍倍比稀释的核小体溶液和包被缓冲液，从最上一排孔的0.1微克/50微升开始，每个稀释系列均需设置三个复孔。

请记得设置仅含包被缓冲液的孔作为对照。次日，在4°C条件下将酶标板孵育过夜。使用洗板机在室温下用含0.5% Tween-20的PBS溶液洗涤酶标板，每孔200 µL，共洗4次，累计洗涤时间为10分钟。

现在每孔加入 100 µL 封闭液，在室温下于旋转摇床上孵育 1 小时。孵育结束后，将板倒置并在水槽上方快速振荡以去除封闭液。接着，每孔加入 50 µL 用含 5% PSA 的 0.05% PBS-Tween 20 溶液稀释的一抗，于室温在旋转摇床上孵育 1 小时。

一抗孵育结束后，使用洗板机按照之前的方法洗涤平板。洗板程序完成后，在每孔中加入50 µL用含5% BSA和0.5% Tween-20的PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，置于旋转器上室温孵育1小时。二抗孵育结束后，再次按照之前的方法洗涤平板。

使用洗板机进行显色反应。每孔加入50 µL TMB ELISA底物，室温孵育10分钟。ELISA板各孔将呈现蓝色，颜色深浅与每孔中核小体修饰的含量成正比。

此时应终止反应，每孔加入50 µL的2 N硫酸。颜色将变为棕色，随后以1500 ×g离心2分钟，以消除任何气泡。

此时，该酶标板已可使用比色法酶标仪进行定量检测。最后，在450纳米波长下读取酶标板数据，并导出结果用于分析。若操作得当，掌握该技术后可在两天内完成实验。

该技术为干细胞研究领域的研究人员探索整个表观蛋白质组水平上分化和重编程事件的表观遗传学响应打开了大门。