利用二次电喷雾电离质谱法（SESI-MS）表征细菌挥发性物质

二次电喷雾电离质谱（CS EMS）能够在无需任何样品预处理的情况下分析细菌挥发性物质。细菌培养物的顶空气体被二氧化碳带入SSI反应室。当挥发性物质穿过SSI反应室时，会通过电喷雾云并发生电离。

离子化后，挥发性物质被引入质谱仪进行分析。过量的载气和未发生反应的细菌挥发性物质则通过0.22微米滤膜过滤，以去除任何细菌因子，作为额外的防护措施，随后排入化学通风橱。最终，该CSI质谱方案可在数分钟内提供细菌挥发性物质的特征指纹图谱。

我们预计该技术可应用于多种场景，包括呼气分析、传染病的呼吸检测，甚至可应用于食品系统，以快速检测存在于食品表面或内部的病原体。该技术具有多个主要优势。相较于现有的气相色谱-质谱联用（GCMS）、筛选质谱（sift-MS）和质子转移反应质谱（PTR-MS）等方法，本方法的首要优势在于，挥发性物质在分析前无需任何预处理。

其次，可以对挥发性混合物中的特定离子进行碎裂，从而更易于化合物的鉴定。第三，该方法具有快速的特点，通常耗时不到五分钟。

为分析每个样品，应根据物种的生长需求以及挥发性物质向质谱仪的有效输送情况，选择合适的培养容器。在本示例中，我们选用标准的 100 毫升 Pyrex 培养瓶。细菌产生的挥发性物质通过载气流输送至质谱仪，以构建载气系统。

气体管路需连接带有螺纹盖的培养瓶，螺纹盖上至少有两个鲁尔接头。在接种样品前，将气体进气管和出气管穿过鲁尔接头，并堵塞任何多余的接口。加压容器后浸入水中检查是否泄漏。

气体泄漏是导致结果异常（如信号微弱或缺失）的主要原因。挥发性离子信号会在过夜培养期间增长。对大肠杆菌（E. coli）K-12和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1在LB Lennox培养基中进行培养，每种菌株制备两个生物学重复。

准备九个无菌培养瓶，每瓶含有50毫升LB Lennox培养基，另准备一个未接种的培养瓶作为空白对照。将每种过夜培养物分别接种到两个样品瓶中，以建立技术重复。将培养物和空白对照在37摄氏度下孵育24小时。由于CEMS专门用于采集挥发性物质，在使用仪器前应避免使用有香味的个人护理产品。

在实验过程中，应将实验室中所有挥发性化学品加盖密封，并尽可能控制气流，以防止仪器和气体传输管路受到污染。若使用有活性的生物试剂，需在载气管路中安装适当孔径的过滤器。这些过滤器不会干扰挥发性物质向sesi反应室的转移，但可能会略微影响气溶胶转移的效率。

为了确认电源已关闭且系统已放电，请检查电源供应器上的指示灯是否熄灭。确保万用表上的电压为零，并将电极导线接地。此时，安装用于分析的电喷雾溶液。

在正离子模式下，我们使用含有0.1%甲酸、5%甲醇和94.9%水的电喷雾溶液。为了获得最佳的信号强度和稳定性，打开二氧化碳载气并将其流速设置为每分钟2升。对电喷雾储液罐施加压力，以每秒5纳升的流速将电喷雾溶液输送至反应室。接着打开电压电源，并将电压调节至2.5千伏。

施加的电压会影响信号离子强度以及电喷雾泰勒锥的稳定性，对于本系统而言，电压在2至5千伏之间时可获得最佳结果。在正离子模式下操作时需谨慎，因为此时电离源的金属表面可能产生危险的电击。现在设置一种调谐方法以监测SEMS谱图。

取消勾选多通道采集（MCA）复选框。将采集时间设置为10至15分钟，并开始数据采集。观察载气背景的谱图，微调施加的电压，以获得稳定的总离子色谱图和可重复的扫描结果。

继续采集光谱和A TIC五分钟，以确保仪器在仪器已投保的情况下稳定运行。根据实验需求输入采集参数。为后续实验记录载气背景光谱。

采集空白谱图。将载气流导入旁路线，然后在阀门关闭的情况下将空白样品连接至仪器的传输管线。打开通往样品瓶的阀门，并关闭旁路线的阀门。

为了获得可重复的谱图，需让系统平衡30秒，在此期间反应室内的湿度将趋于稳定。为确保系统已达到平衡状态，请监测总离子流（TIC），在平衡过程中TIC会发生变化，随后趋于稳定。

系统平衡后，开始采集谱图。采集完成后，首先打开载气旁路管线，然后关闭样品阀，再取出样品瓶。

最后，取下样品瓶。用载气冲洗系统两到四分钟，以去除传输管线中的水分和吸附的挥发性物质，防止样品间的交叉污染。对每种细菌样品间歇性地采集挥发性指纹数据，同时定期收集额外的空白谱图，以确保彻底完成空白扣除。

大肠杆菌和产气克雷伯菌在LB Lennox培养基中于37摄氏度有氧培养24小时后，其正离子模式挥发性指纹图谱具有明显差异。大肠杆菌的挥发性质谱图在质荷比118处由诱导峰主导，而肺炎克雷伯菌的质谱图则包含更多种类的可加成蛋白质峰。

在进行该实验操作时，重要的是记录已为分析优化的仪器参数，例如施加电压、电喷雾溶液组成以及载气流速。同时，应保留代表性质谱图的记录，以便将来能够重复实验分析。切记，操作病原菌和高电压设备可能存在极高危险性。

因此，实验过程中应始终采取预防措施，例如限制对 css CMS 的访问。现在，您应该能够在您的系统中重复获得细菌挥发物的 CSS 和 EMS 谱图。祝您实验顺利。