利用同系斑马鱼中的有限稀释细胞移植法量化肿瘤传播细胞的频率

极限稀释细胞移植实验是评估实验动物模型中自我更新潜能的金标准。在本实验中，将单细胞期的同系斑马鱼胚胎注射 rag2 MIC 和 RAG2 GFP，以产生可发育出荧光标记的T细胞急性淋巴母细胞白血病的转基因斑马鱼。在出生后60天，从斑马鱼中分离出原代白血病细胞，然后通过荧光激活细胞分选进行纯化。

接下来，将细胞以极限稀释法移植到成年斑马鱼的腹腔中，并持续监测鱼类肿瘤生长情况，最长可达90天。最后，使用极限稀释分析统计学软件程序来定量原始肿瘤中白血病传播细胞的频率。极限稀释细胞移植分析可使研究人员准确评估肿瘤组织中所含自我更新细胞的数量。

正是这些具有自我更新能力的细胞推动了癌症的形成，并最终导致疾病复发。在斑马鱼模型中进行极限稀释移植实验的主要优势在于，每次实验可移植大量斑马鱼，从而在确定自我更新型肿瘤传播细胞频率时获得更高的精确度。该方法有助于深入了解T细胞急性淋巴细胞白血病中的肿瘤传播细胞。

该方法也可用于研究其他斑马鱼癌症模型。今天，实验室的博士后研究员 Jessica Blackburn 和技术员 Sally Liu 将为您演示实验操作流程：为线性化 Rag2 CM 和 RAG2 G-F-P-D-N-A 载体，需在 37°C 条件下，用限制性内切酶 NotI 对每种质粒各 10 微克进行过夜消化。经苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀后，将每种质粒溶解于 20 微升水中。

通过将每种消化后的质粒与20微升、10微升和5微升的高分子量DNA Marker按1:1、1:5和1:10的比例稀释，在1%琼脂糖凝胶上测定DNA浓度。随后将DNA稀释至终浓度为60纳克/微升，用于注射CG一株syngen。向斑马鱼胚胎注射250纳升、浓度为30纳克/微升的rag二CM和30纳克/微升的DNA。

将Rag2-GFP注入单细胞期斑马鱼胚胎，小心地将DNA直接注入细胞而非卵黄中。将注射后的胚胎置于28.5°C条件下培养，在受精后24小时及5天时移除死亡胚胎。注射约28天后，将存活个体转移至大型养殖水箱中。在培养皿中向25毫升养殖用水加入200微升浓度为4纳克/毫升的Tricaine，以麻醉斑马鱼幼体。

使用落射荧光显微镜检测GFP荧光，观察幼鱼中荧光标记的TALL发育情况。将肿瘤阳性的幼鱼与阴性幼鱼分开，以确保在分析中不会遗漏任何白血病鱼。阴性幼鱼可在后续时间点再次检查，待肿瘤可能增大后再进行观察。每周至少使用落射荧光显微镜观察一次荧光标记的白血病鱼，以监测肿瘤的生长情况。

当GFP阳性白血病细胞在动物体内占比超过50%时，向含有九毫升鱼系统用水的培养皿中加入一毫升浓度为每毫升四纳克的Trica S，以处死斑马鱼。将鱼转移至新的培养皿中，该培养皿内含有一毫升含5%胎牛血清的0.9倍PBS溶液，用刀片研磨组织，通过移液操作使大的细胞团块解离，随后将细胞悬液经40微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。

用移液器将500微升细胞加入到一个4毫升的聚苯乙烯管中。加入1微升浓度为1毫克/毫升的碘化丙啶，以标记死细胞，涡旋混匀，然后将细胞置于冰上。同时准备野生型CG1鱼，收集正常血细胞，用于在移植过程中作为肿瘤细胞的载体；将4毫升含5% FPS的0.9倍PBS加入50毫升管中，总体积为5毫升。

将正常血细胞用含5% FBS的0.9 × PBS稀释至3 × 10⁵ 个细胞/毫升，然后每孔加入100 µL至96孔板中。使用荧光激活细胞分选仪，将GFP阳性、PI阴性的肿瘤细胞按指定剂量分选到含有正常血细胞的96孔板各孔中。此外，将10,000个细胞分选至不含正常血细胞的孔中，并使用FACS重新分析，以评估分选细胞的纯度和活力。将96孔板在2000 × g离心10分钟，使细胞沉淀。

移除95 µL上清液，并将细胞重悬于剩余的5 µL中。使用26.5号微量注射器将细胞悬液注射到60日龄以上的成年同系型斑马鱼的腹腔内。移植前无需对斑马鱼进行麻醉。

移植约28天后，将45条斑马鱼每条接种10个白血病细胞，20条斑马鱼每条接种100个细胞，7条斑马鱼每条接种1000个细胞，以及5条斑马鱼每条接种10,000个TALL细胞。使用激发波长为485/20、发射滤光片为530/25的落射荧光显微镜检查受体斑马鱼，以检测GFP荧光。

记录每批注射鱼类中呈阳性的鱼的数量占注射鱼总数的比例。每隔14天对鱼类进行一次重新检查，持续最多90天，并记录呈阳性的鱼的数量。当肿瘤呈阳性的鱼数量增多时。

通过三卡因过量处死动物，将结果输入表格，并将数据上传至基于网络的极限稀释分析软件，以确定原代 T-ALL CG1 品系胚胎中自我更新型白血病细胞的频率。这些胚胎被注射了 RAG2-cmyc，RAG2-GFP 幼鱼经筛选获得原代 T-ALL。根据先前的研究，在注射后 28 天，约 5% 的注射鱼在其胸腺中出现 GFP 阳性的 T 细胞，且这些鱼将 100% 发生白血病。在此，从 65 日龄患病动物中分选出荧光标记的 T-ALL 细胞，并用于极限稀释细胞移植实验。首先，绘制门控以选择单个细胞。

然后选择碘化丙啶阴性细胞。最后绘制门控以仅选取GFP阳性的白血病细胞进行分选。在此例移植了T-ALL的斑马鱼中，第28天时的早期肿瘤表现为注射部位附近存在GFP阳性细胞区域。

尽管部分 TLS 肿瘤进展更为明显，在本实验中已扩展至充满腹腔，但总共移植了超过 220 条动物，这一过程可由一人在数小时内轻松完成。使用 elda 软件进行数据分析显示，平均每 135 个 T 全细胞中即有一个具有自我更新能力的白血病传播细胞。观看本视频后，您应能充分掌握如何将肿瘤细胞以极限稀释法移植至同系斑马鱼的腹腔，以及如何利用所得数据确定特定肿瘤内肿瘤传播细胞的频率。

利用基因修饰动物开展的进一步研究可能有助于揭示调控这些肿瘤传播细胞自我更新的机制。