利用基于病毒的Cre重组技术对小鼠出生后脑发育中基因功能进行嵌合体分析

本实验的总体目标是在出生后脑发育阶段操控基因功能。首先选择并制备合适的病毒，将其装入注射器并准备注射设备；随后将病毒注射到新生小鼠幼崽的脑内；最后一步是处死动物并对注射区域进行成像。

最终，可以通过免疫荧光显微镜获得显示对照细胞和基因敲除细胞差异标记的结果。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如出生后发育阶段是如何受到遗传调控的。对于注射，可使用市售的腺相关病毒溶液，其滴度通常为每毫升10的12次方个基因组拷贝，以操控大量细胞。

如果需要进行稀释或标记，可从1到10倍的稀释开始。将病毒在冰上解冻后，立即转移预稀释体积至无菌的250微升PCR管中。将稀释液保持在冰上。

通过选择合适的注射器并将其连接至装样针头来准备注射泵。接着，轻柔吸取病毒溶液，直至在注射器中观察到一个非常小的气泡，可使用惰性装样染料使此步骤更简便。现在，用固定夹将注射器固定在泵上。

然后轻轻地将连接管连接在注射器和针头夹持器之间。确保注射针与针头夹持器内部的连接管直接接触。接着缓慢推动溶液通过连接管，直至针尖处出现微小液滴。

使用泵上的支架将柱塞紧靠推块固定。将注射速率设置为每分钟八微升，并将注射体积设置为一至二微升之间。然后调节泵的注射器直径设定值，以匹配所用注射器的直径。

最后，为了在恢复期间保护幼鼠，将加热板设置为 38 摄氏度，并用一张纸巾覆盖。根据 IACUC 批准的实验方案，通过低温麻醉处理零日龄（P zero）或一日龄（P one）小鼠幼崽，以准备注射。将几张纸巾用水浸湿后置于冰上。

然后将四到五只幼鼠放在纸巾上，彼此充分分开。轻轻将纸巾折叠覆盖在幼鼠上，在纸巾上方放置少量碎冰，并将幼鼠冰浴约五分钟。幼鼠在冰上可安全保存长达15分钟，仍能良好恢复。

现在将一只麻醉后的幼鼠放置在固定板上，以便最佳地接触注射部位。例如，将动物腹部朝下平放，可最方便地接触大脑皮层。可用创可贴将幼鼠固定在原位，用手稳定幼鼠头部，并拉紧皮肤以防止其移动。

然后定位颅骨的解剖学标志，如人字缝，并用另一只手选择一个可重复的注射点，轻柔地将针头穿过颅骨。如果针头不能轻易穿透颅骨，不要用力推进。相反，应重新调整针头位置，并再次轻柔尝试。

注射深度因动物个体和品系的不同而略有差异，对于皮层而言，通常深度为0.5至1毫米即可。现在，由一位同事启动泵以注入病毒溶液，从而尽量减少手部移动。理想情况下，可在注射完成后使用脚踏开关启动泵。

保持针头位置数秒钟，然后在固定幼鼠头部不动的情况下平稳地抽出针头。现在，将幼鼠置于覆盖的加热板上，使其恢复5到10分钟。

在此期间，继续对其他幼崽进行注射。待所有幼崽恢复粉红色外观且均能活动时，用其原窝垫料轻轻擦拭幼崽身体，之后方可将其放回母鼠身边。

否则，它们可能会被视为陌生幼崽，母鼠在幼崽被放回后很可能会将其杀死。用丙酮或70%乙醇完全填充注射器，以清洗注射装置。如果使用了对丙酮敏感的部件（如sano、acurate、粘合剂等），则每次使用新鲜溶液，将溶液在注射装置中反复冲洗数次。

这将清除任何残留的病毒溶液，并使溶剂沉淀后蒸发。冲洗装置后，用漂白剂对操作区域进行消毒，使其为下一位实验者做好准备。导师提示：成功的操作技术可在注射部位产生强烈的神经元感染。

向特定脑区（如皮层和上丘）注射通常会产生局部感染，向邻近区域的扩散较少。使用高滴度病毒溶液会使邻近区域（如海马）更易被感染，而使用低滴度病毒溶液则通常仅在注射位点附近产生稀疏感染，例如在中线处的小脑注射。被感染细胞的数量应与所注射病毒溶液的滴度相关。

例如，将两种高滴度的重组腺相关病毒8型（rAAV8）溶液混合后注入小脑，这两种病毒分别表达不同的荧光蛋白，可感染大量被不同标记的浦肯野细胞。相反，注入低滴度的病毒溶液则可实现稀疏感染，有助于单个细胞的可视化观察。荧光标记的神经元可在新鲜切开的活体组织中直接观察，也可进行免疫染色处理后再行观察。

这一步可增强内源性荧光信号，便于后续通过宽场或共聚焦荧光显微镜进行图像采集。最后，RAAV八型能够感染大脑皮层中多种类型的神经元，并对细小突起实现强效标记。一旦掌握，该技术若操作得当，约30分钟内即可完成。