器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

本实验的目的是研究健康脑活动自组织形成神经元雪崩的现象，这是大脑皮层临界状态动力学的标志性特征。通过将冠状切面的分层皮层切片与中脑切片结合，实现这一目标，其中中脑切片为皮层提供发育过程中至关重要的多巴胺能输入。第二步是将皮层-中脑共培养物培养在多电极阵列上，从而可在培养物中对多个位点进行神经元活动的刺激与记录。

接下来，在定制设计的培养箱中，我们将共培养体系静置1至2周，使其逐渐铺展、扩展并贴附于MEA表面，培养箱会周期性地使培养物暴露于正常空气和培养环境之间。在此过程中可获得液体培养结果，显示时空局部场电位簇发会自发地自组织形成神经元雪崩。该结论基于MEA记录数据以及离线雪崩分析，后者识别出雪崩规模符合幂律分布。

与现有方法（如分离培养）相比，该技术的主要优势在于其系统神经科学的特性。我们可以将多个脑区共同培养，这些多区域培养物在大尺度上（如皮层分层和投射系统）建立了正确的脑组织结构。该技术的应用不仅限于神经元雪崩的研究。

例如，我们可以在精确控制的体外条件下，在网络水平上研究刺激与响应的关系。该方法的可视化演示至关重要，因为正确应用血浆凝血酶混合物以及将组织放置在多电极阵列（MEA）上的操作难以掌握。这些步骤需要准确把握时机、合适的温度梯度，并避免直接接触精密的MEA表面。

为记录准备无菌可密封玻璃室时，首先用带聚四氟乙烯（Teflon）塑料盖的螺纹玻璃圆筒，在螺纹底部上方约两毫米处切割。这些部件用于确保培养室能够牢固且紧密地封闭。然后通过用水冲洗玻璃环三次，再在纯度为200 proof的乙醇中煮沸五分钟，以清洁玻璃环。

将这些部件放置一旁晾干。需要使用硅溶液将玻璃环固定在MEA表面。采用Cell Guard 180 4硅弹性体试剂盒，充分混合15毫升的A组分和B组分，然后静置15分钟以去除气泡。

将溶液分装为每份1毫升，置于Eloqua中，并在-20摄氏度下保存以备后续使用。现在，用注射器吸取1毫升硅胶，注射器需装配细规格针头，并在23摄氏度条件下将其涂布于玻璃环的未抛光切割表面，从而将玻璃环粘附至MEA上。然后将玻璃环居中放置于MEA上，并在玻璃环外周再涂布一层硅胶，以增强密封性。

将此物在约60摄氏度的加热板上静置固化1至2小时。接着，在超净工作台中对MEA腔室及腔室盖进行灭菌处理：先用去离子水冲洗三次，再用70%酒精冲洗三次，最后一次冲洗使用酒精。让腔室在酒精中静置10分钟。

随后将培养室和盖子内部暴露于紫外光下照射10分钟。在120摄氏度下高压灭菌45分钟。灭菌完成后，让其自然干燥。

现在用多聚赖氨酸（poly D lysine）包被培养室内的MEA表面。本实验所用的新MEA具有较强的疏水性，因此需通过反复滴加液滴的方式进行包被。从电极网格中吸出溶液。

将盖子盖紧，以密封MEA培养皿，便于储存和后续使用。该操作可获得约12份共培养所需的皮层和腹侧被盖区（VTA）组织，应在超净台内无菌条件下进行，并使用出生后1至2天健康动物，整个组织采集过程总时长应少于1小时。断头后，首先用剪刀在两侧做横向剪切，去除头颅皮肤，开始脑组织的取出。

使用精细的眼科剪去除颅骨并剪开，沿矢状中线做一纵切，并在大脑皮层与小脑交界处做一冠状切口。将这四片颅骨瓣翻折，以暴露脑组织。接着用锋利的解剖刀片经嗅球处行额状切开。

然后将解剖刀从脑组织下方每隔四分之一周推进一次。轻柔地将脑组织从颅骨中取出，并使其滑入预冷的保存液中，以实现快速冷却和临时储存。

对另外两个大脑重复上述步骤。为获取腹侧被盖区（VTA）组织，将大脑转移至无菌干燥的培养皿中。使用小刮勺，轻轻将每个大脑横向滑动约一厘米，以去除多余的液体。

然后使用刀片在小脑水平处进行冠状垂直切割，以去除脑干。现在将琼脂块粘接到切片固定盘上，以便在切片过程中对脑组织进行机械固定。接着，在固定盘上的琼脂块前方几毫米处涂抹一条薄薄的超级胶水，使用小刮刀操作时应避免胶水接触到琼脂块。

将每个脑组织的额极朝下转移并固定。确保额极被粘附在固定盘上，且腹侧接触琼脂，无任何胶水残留。这可保证切片过程中良好的机械稳定性，并便于切片后轻松拾取切片。

接下来，将固定好脑组织的安装盘小心浸入盛有冷 gaze 溶液的振动切片机托盘中并固定。然后使用经过仔细清洁的刀片，在最高振动频率和相对较低前进速度的条件下，切出中脑400微米厚的冠状切片，并用带有吸球的倒置巴氏移液管收集包含腹侧被盖区（VTA）的切片，转移至盛有无菌冷 gaze 溶液的35 mm × 10 mm培养皿中，用于皮层切片。重复前述切片步骤，但在大脑皮层与小脑之间进行一次垂直切割，并将四个脑组织以额极朝上的方向安装。

从纹状体水平开始，获取约三片厚度为350微米的冠状切片。现在使用由剃须刀片断裂制成的微型刀具，在体视显微镜下分离出宽度约为2毫米、包含腹侧被盖区（VTA）的额叶皮层和中脑区域的冠状切片。将组织切片分别收集于盛有冷置格氏溶液的小培养皿中。

开始在MEA腔室中固定组织时，首先将MEA置于室温下的体视显微镜下，并调焦至电极阵列清晰可见的位置。随后，在洁净、无尘且无菌的电极阵列基质上，居中滴加25微升血浆。使用小刮铲小心地将皮层和腹侧被盖区（VTA）切片移入血浆液滴中。

现在将MEA放置在冷却板上并重新对焦视野。静置约15秒使其冷却，然后向血浆液滴中加入25微升凝血酶。接着使用凝血酶移液枪头，以轻微的环形动作小心地将血浆与凝血酶混合物均匀涂布于MEA表面。

注意不要直接触碰脆弱的电极阵列。接下来，将大脑皮层轻轻放置在阵列上，使背侧边缘对准阵列的第二电极行。这样，发育中的表层最终将覆盖阵列的其余部分。

然后将VTA放置在皮层切片腹侧边缘附近。现在盖上MEA腔室盖，松散封闭以保持高湿度。将MEA培养装置置于室温下的超净台内静置约六分钟，以使血浆凝血酶发挥作用，完成凝固和凝集过程。

同时，重复上述步骤以制备另外三个培养物。接下来，使用带有25号五分之八英寸针头的1毫升注射器，将600微升培养基以小液滴形式小心地加入到培养室中。然后紧密关闭MEA室，并将MEA培养组件放置于培养箱内摇动储存托盘上。

体外培养两天后，加入10微升有丝分裂抑制剂。随后在体外培养第四天及此后每隔四天，更换60%的培养基。在正常生长过程中，培养物会明显变扁平，并略微向背侧扩展。

由于表层皮质层的发育，健康的培养物在明场下表现为不透明的灰白色组织。相反，明亮且有反射性的囊泡是培养物制备后约10至12天时死亡退化细胞的特征，此时培养物已准备好进行记录和刺激。开始记录前，需将MEA从储存托盘转移至记录头阶段。

记录局部场电位（LFP）时，使用1至200赫兹的带通滤波器。多单元活动也可通过300至3000赫兹的带通滤波器进行研究。健康的自发性活动通常以大小和持续时间各异的簇状放电形式出现。

为了研究局部场电位（LFP）与单个神经元放电活动之间的关系，我们可以计算LFP的触发平均尖峰。对于这些皮层培养物，负向LFP偏转与神经元放电相关，可用于记录刺激诱发的活动。首先，通过控制刺激发生器的软件设定刺激的时间波形和幅度。

一种有效的刺激范式是采用电流控制、电荷中性、单次冲击的双相方波。接下来，选择将用于传递刺激的电极。典型的刺激诱发的局部场电位（LFP）反应与自发性活动爆发相似。

屏蔽电路在刺激期间断开放大器连接，以减少刺激伪迹并防止放大器饱和。刺激电极需要数秒时间从刺激中恢复，因此无法用于记录响应活动。在多电极阵列（MEA）上，神经活动往往以时空簇的形式出现，表现为某一电极处的活动常伴随其他位点的同步活动。

与此同时，通过叠加显示相隔数秒出现的三个簇，展示了此类活动期间局部场电位（LFP）的典型波形。当提取超过多个负标准差阈值的负LFP（NLFP）峰时，可在一秒钟时间窗内观察到多个电极上的负LFP偏转；以NLFP峰时间为形式的活动可方便地用Rasta图进行可视化展示，其中点的列代表不同电极上近似同时发生的负峰事件（NPS）。该活动在时空上的组织模式相当复杂。

在较低时间分辨率下看似均匀的柱状结构，在较高时间分辨率下则由多个独立的簇组成，依此类推。空间、地理时间（GEOTEMPORAL）和局部场电位（LFP）簇在皮层网络中的出现具有高度组织性。更具体而言，神经元雪崩的组织具有尺度不变性。

通过计算在给定时间分辨率 Delta T 下的簇大小概率，可以证明这一点。此处的簇由发生在相同或连续时间区间内的 NLFP 构成。当簇的大小以每簇总 NFPS 数量或每簇整合的 NLFP 振幅表示时，簇大小分布呈现出接近 -1.5 指数的幂律关系。观看本视频后，您应能够充分理解如何精细地解剖脑组织，并在多电极阵列上培养神经元，以研究神经元活动的自组织特性。

这些方法还被用于研究皮层网络中自发活动与刺激诱发活动之间的关系。