间皮细胞分离：一种从人网膜组织标本中分离原代间皮细胞的技术

人原代间皮细胞（HPMCs）排列在许多内脏器官表面，例如大网膜或腹腔内脂肪组织层。

为了分离间皮细胞，首先将人网膜标本浸入适当的缓冲液中，以去除多余的红细胞（RBCs）。接着，将网膜置于玻璃培养皿中，剪切成小块。此步骤可解离组织，释放出人腹膜间皮细胞（HPMCs）以及混杂的红细胞。

将组织块转移至锥形管中，并静置所需时间。富含低密度脂肪的绞碎组织会上浮至顶部，而致密的细胞成分则沉降至底部。随后，将底部含有腹膜间皮细胞（HPMCs）和红细胞（RBCs）的液体吸出，转移至新的离心管中。

离心收集细胞。弃去含有上清液的缓冲液。将沉淀重悬于间皮细胞生长培养基中，并孵育所需时间。该培养基可促进人腹膜间皮细胞（HPMCs）的选择性生长，而非红细胞（RBCs）。

使用光学显微镜观察细胞，以确认立方状人腹膜细胞的生长情况。

获取人手术大网膜标本后，立即将样本浸入室温的磷酸盐缓冲液（PBS）中。浸入后2小时内，将大网膜转移至含有20毫升新鲜PBS的50毫升锥形管中。将剩余的含有原代人腹膜间皮细胞（HPMC）和红细胞的PBS洗涤液转移至新的50毫升锥形管中，离心沉淀细胞。

然后，将离心管中的内容物倒入一个10厘米的无菌培养皿中，并使用两把手术刀将组织切成5立方毫米大小的组织块。为了分离原代人腹膜间皮细胞（HPMC），将大网膜组织块转移至一个50毫升的锥形离心管中，静置1分钟，使较大的组织块浮至液面。HPMC将与红细胞一起沉降至离心管底部。

使用移液器将含有间皮细胞和红细胞的 PBS 洗液转移至含有沉淀细胞的离心管中，并离心收集细胞。然后，向大网膜中加入 20 毫升新鲜 PBS，按照上述方法再重复收集三次含有 HPMC 和红细胞的 PBS 洗液至原始的细胞沉淀中。

最后一次离心后，将细胞接种于一个75平方厘米的培养瓶中，加入15毫升完全生长培养基。为了从大网膜样本中进一步分离HMP细胞，将剩余的固体组织在20毫升PBS中以200 RPM、37摄氏度振荡。10分钟后，让样本静置1分钟，使固体组织上浮至管顶。

然后，从试管底部收集 HPMC 和红细胞，方法如前所述。现在，将二次洗涤后的细胞离心沉淀，并接种于另一个 75 平方厘米的培养瓶中，加入 15 毫升完全培养基。为了分离残留的 HPMC，此次将组织在 PBS 与 10 毫升胰蛋白酶-EDTA 的混合液中再振荡 10 分钟，并将这些 HPMC 和红细胞接种至一个 75 平方厘米的培养瓶中。

随后，在37°C、5%二氧化碳的湿润环境中培养细胞。在第3天和第5天，每次向培养板中的细胞添加15毫升新鲜的完全培养基，不更换旧培养基。HPMC可通过其立方状形态以及表达细胞角蛋白-8和波形蛋白来鉴定。