外泌体分离：利用蔗糖垫密度梯度超速离心法从培养细胞条件培养基中分离外泌体

外泌体——携带功能性生物分子的纳米级膜结合囊泡——  由大多数细胞类型主动分泌，可从体外细胞培养上清液中分离获得。分离外泌体时，首先收集目标细胞培养物的上清液或条件培养基。该条件培养基中包含外泌体、蛋白质、细胞碎片及其他囊泡。

离心培养基以沉淀细胞碎片。收集含有外泌体的上清液，并通过细胞滤网过滤，以去除较大的囊泡。将一定体积的过滤后培养基转移至新的离心管中。接着，混合适当浓度的蔗糖和重水，制备蔗糖垫——即不连续蔗糖梯度。 

向含有培养基的离心管中加入特定体积的蔗糖垫溶液；该溶液会在底部形成独立的一层。随后，高速离心该离心管。蔗糖垫有助于外泌体从培养基迁移至蔗糖溶液中，同时维持外泌体的完整性。高密度的蛋白质污染物则停留在蔗糖溶液与培养基之间的界面处。

将含有外泌体的主要蔗糖层小心转移至含有合适缓冲液的新离心管中。高速离心以获得纯化的外泌体沉淀。弃去含有蔗糖的上清液及任何蛋白质污染物。将外泌体沉淀重悬于缓冲液中，并于低温下保存，直至后续使用。

为预清除收集的条件培养基，需在 4 摄氏度下以 500 ×g 离心 5 分钟。将上清液转移至新管中，并弃去沉淀。用回收的上清液重复此离心步骤后，再次收集上清液，并弃去沉淀。

然后，在 4 摄氏度条件下，以 2,000 × g 离心回收的上清液 15 分钟。保留上清液，弃去沉淀。使用连接在 20 毫升注射器上的 0.22 微米滤器将上清液过滤一次，收集至新的离心管中。

同时，为制备氘代水中25%的蔗糖溶液，准确称取1.9克蔗糖于通用管中，然后加入氘代水，直至总重量达到7.6克。随后，用22.5毫升预清除的条件培养基填充超速离心管。

将玻璃移液管放入试管中。通过移液管加入3毫升蔗糖溶液，使溶液在条件培养基下方形成独立的一层。小心地将含有分层条件培养基和蔗糖溶液的试管放入水平转子的吊桶中。

将离心管固定到转子中。将转子放入超速离心机，在 4 摄氏度下以 100,000 × g 离心 1.5 小时。使用 P1000 移液器（其吸头连接一个 10 微升吸头）从离心管中分两次、每次 1 毫升收集 2 毫升蔗糖层，并将其加入含有 20 毫升过滤 PBS 的超速离心瓶中用于洗涤。

将离心管放入固定角转子中，在 4 摄氏度下以 100,000 ×g 离心 1.5 小时。使用 10 毫升血清移液管小心吸除上清液。用 400 微升过滤后的 PBS 重悬沉淀。