脊髓神经元分离：一种用于体外研究的新生大鼠脊髓神经元密度梯度分离方法

为分离脊髓神经元，取新生小鼠的脊柱并将其置于培养皿中。用生理缓冲液冲洗脊柱以释放脊髓。将脊髓转移至冰冷的神经元培养基中，以促进细胞存活。

接着，将脊髓组织切碎，并将组织碎片转移至含有新鲜神经元 培养基的离心管中。将离心管置于摇床水浴中孵育，以进行适应性培养。孵育结束后，移除用过的培养基，并加入消化液。消化酶可降解组织基质，使细胞解离松散。

通过将组织碎片吸入移液管并迅速排出内容物，进行吹打，使单个细胞释放到悬浮液中。然后将该悬浮液转移至含有密度梯度介质的离心管中，离心。

离心后，管中的表层含有组织碎片。第一层包含少突胶质细胞和星形胶质细胞。第二层和第三层包含神经元，其中第三层纯度最高。最后，沉淀物中含有小胶质细胞。

将第三层收集到新的离心管中，并加入神经元培养基以稀释密度梯度介质。离心以沉淀神经元。弃去上清液，将沉淀重悬于神经基础培养基中，以保存神经元用于后续实验。

开始此操作时，使用剪刀将已处死的幼鼠头部与身体分离。接着，将幼鼠的尾部和四肢固定在操作台上，使其背侧朝上。然后，使用弯头虹膜剪剪除皮肤。随后，从髋部上方的腰段脊髓处切断脊髓，并在胸腔两侧进行切割，以将躯干与身体其余部分分离。

将样本依次放入三个含有5毫升无菌PBS的10厘米培养皿中，每个培养皿洗涤10秒，以去除多余的组织。随后，将装有5毫升无菌PBS的22号针头和注射器插入脊柱尾端，由尾向头方向冲洗，使脊髓冲出并进入第四个培养皿中。

将脊髓转移至含有5毫升HABG的15毫升离心管中，并置于冰上。避免压碎脊髓，并对剩余幼鼠重复上述操作。理想情况下，为保证神经元分离的活性，每组幼鼠的操作时间不应超过30分钟。

为制备密度梯度，先在四个15毫升离心管中分别配制四层溶液。然后，将每层溶液各取1毫升依次加入一个新的15毫升离心管中。从底部开始加入第1层，依次逐层叠加，直至最上层为第4层。添加过程中应避免扰动各层，避免剧烈操作导致混合。接下来，将消化液加入剪碎的组织中。将样品置于30摄氏度水浴摇床中孵育。随后，从水浴中取出组织，静置数分钟使其沉降。

进行吹打时，先吸除多余的消化液。将组织悬浮于2毫升HABG中。使用细孔移液管在45秒内吹打10次，注意避免引入空气，否则会显著降低细胞存活率。吹打是该实验流程中最关键的步骤之一。应小心地将组织吸入并排出火抛光移液管，避免用力过度导致神经元死亡，或动作过于轻柔而造成收获率过低。

随后，吸出上清液顶部的2毫升，转移至新标记为“收集”的15毫升离心管中。重复收集步骤两次，共获得6毫升上清液。接下来，将收集管中的内容物缓慢转移至先前制备好的梯度管中，注意避免破坏梯度。

为纯化神经元，将梯度管在800 × g、22摄氏度条件下离心15分钟。收集目标层，并转移至新的15毫升离心管中。为获得最高纯度的神经元分离，应收集第3层；若需更高得率而可接受较低纯度，则收集第2至第3层。

接下来，通过向新收集的各层中加入 5 毫升 HABG 来稀释密度梯度。在 22 摄氏度下以 200 × g 离心 2 分钟。2 分钟后，弃去上清液，并通过轻弹沉淀将细胞重悬于 5 毫升 HABG 中。随后，再次在 22 摄氏度下以 200 × g 离心 2 分钟。然后，弃去上清液，并通过轻弹沉淀将细胞重悬于 3 毫升神经基础培养基中。