利用免疫组织化学技术检测脑组织中的异常朊蛋白

取一张带有固定哺乳动物脑切片的载玻片，该切片显示错误折叠的朊病毒蛋白聚集体。

用甲酸处理切片，以降低朊病毒聚集体的感染性。

在水化压力室内用酸性缓冲液处理。高温和酸性pH值可破坏固定引起的蛋白质交联，暴露抗原表位。

将样本浸入过氧化氢中以灭活内源性过氧化物酶，防止产生非特异性背景染色。

将切片放入盖板中，并加入缓冲液以维持组织的水合状态。

加入封闭液，防止非特异性抗体结合。

加入针对朊病毒聚集体的特异性一抗。

去除未结合的抗体分子。加入与一抗结合的生物素标记的二抗。

去除未结合的抗体分子。加入与亲和素结合的生物素化过氧化物酶复合物，该复合物可结合在二抗上的生物素。

加入一种生色底物，该底物可被过氧化物酶氧化生成有色产物。

使用显微镜观察染色后的聚集体。

将组织切片小心浸入室温下的98%甲酸中，持续30分钟。用自来水冲洗切片5分钟，随后用蒸馏水冲洗两次。使用不锈钢染色容器，在压力锅中加入500毫升蒸馏水，并将10毫摩尔柠檬酸缓冲液在98摄氏度下预处理20分钟。

出于质量控制目的，在篮子上贴一段自粘式高压灭菌指示胶带，以监测温度和压力。当警报提示设备已达到设定程序的时间和温度后，将装有载玻片的篮子浸入。接着，启动压力舱的程序至设定点二，并记录该程序的初始压力和最终压力。

为了灭活内源性过氧化物酶，将装有样本切片的切片架浸入含3%过氧化氢的甲醇溶液中，孵育30分钟。用流动水冲洗切片5分钟。沥干后，将切片浸入Tris缓冲生理盐水（Tris-buffered saline）中再孵育5分钟。进行免疫检测时，将每张切片置于已用Tris缓冲生理盐水预润湿的市售盖板架上。

将组织面朝向切片架，载玻片边缘与切片架的两个下端点对齐，注意避免产生气泡。用拇指和食指夹持切片架组件，一只手手指按住样本载玻片顶部，另一只手手指托住切片架底部，然后将组件放入系统的载片架槽中。

为确保组件正确组装，需将磷酸盐缓冲液加入样本载玻片与支架之间的孔中，注意不要溢出。此后，应确保支架与载玻片之间始终保留约 80 µL 的磷酸盐缓冲液。切勿让组织切片干燥。

在加入一抗之前，为降低背景染色，将载玻片样本在含20%正常血清的Tris缓冲盐水中预孵育30分钟，该血清应来源于与二抗宿主相同的物种。无需洗涤组织切片，直接向每个多孔载玻片架的每个孔中加入200微升一抗溶液，在室温下孵育60分钟。

洗涤切片时，用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水充满孔板，静置5分钟。重复洗涤两次。接着，将生物素标记的二抗用含10%马血清的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水按1:200的比例稀释。

根据需要处理的切片数量，配制所需的体积。向玻片架装置的每个孔中加入 200 µL 二抗溶液。室温孵育 30 分钟后，重复使用 Tris 缓冲盐水洗涤。

使用亲和素-生物素复合物过氧化物酶时，需在使用前30分钟配制试剂，并在载玻片板架的每个孔中加入200微升溶液。完成后，将板架置于室温下孵育30分钟。