微孔板肉汤稀释法对结核分枝杆菌复合群进行一线和二线药物的抗菌药物敏感性试验

可用于治疗结核分枝杆菌的药物相对较少，因此对任何药物产生耐药性都令人担忧。本视频文章介绍了一种同时检测结核分枝杆菌对12种不同抗菌药物耐药性的实验方法。因此，快速检测结核分枝杆菌抗菌耐药性的能力，对于控制耐药菌株的增加至关重要。此处用于测试抗生素敏感性。

结核分枝杆菌首先在固体或液体培养基中培养，形成细菌悬液。制备接种物并加入含有12种药物（包括一线和二线药物）不同浓度的微量滴定板中。经培养后，通过镜检箱手动观察或使用半自动酶标仪测定各孔中的生长程度。

所得数据表明了每种测试药物的最低抑菌浓度，并显示了所测试的结核分枝杆菌菌株对哪些抗生素具有耐药性。这些结果有助于选择适当的药物来治疗结核病。您好，我叫Nancy Ek，是明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所分枝杆菌实验室的主任。

今天我们将介绍一种用于结核分枝杆菌抗生素敏感性试验的方法。与现有的宏量肉汤稀释法等方法相比，该技术的主要优势在于可针对每种药物测定最小抑菌浓度（MIC），并能同时对12种抗生素进行检测。本次实验操作将由我实验室的质量专家Kurt Jude在实验台前进行演示。

在进行此操作前，需用患者姓名和标本编号标记一块血琼脂平板、三块Middlebrook 7H10平板、一支含玻璃珠的生理盐水吐温管以及一块微量滴定板。此外，将血琼脂平板和7H10平板标记为纯度检测用途。将其中一块7H10平板标记为1:1菌落计数，另一块标记为1:50菌落计数。

然后将托盘放入传递窗中。接着，穿戴实面前围裙、头罩、手套、鞋套和呼吸器，以准备在三级生物安全（BSL-3）设施中工作。此处使用的是PAPR呼吸器。

然后从传递窗中取出托盘。接下来在生物安全三级设施中，对生物安全柜的表面进行消毒。然后将一张浸有消毒剂的纸巾放入通风橱内，紧邻纸巾的送风面板附近，距离约六英寸处。

放置接种环、移液器及吸头、适当的废弃物容器、Nephi、TER 和涡旋振荡器。生物安全柜准备就绪后，将待检菌株置于纸巾上，同时放置含有 McFarland 0.5 标准比浊管的试管架、添加 OADC 的 7H9 液体培养基以及含盐水珠的试管。此操作体系自固体培养基开始进行。

从患者标本的固体培养基培养物中制备接种物。使用无菌接种环刮取菌落，并将其转移至含吐温-玻璃珠的生理盐水试管中。将悬液涡旋振荡30至60秒。

目视检查样品，将其与麦氏比浊标准进行比较。所转移的菌液量应等于或大于标准量。若不足，则添加更多细菌样品并再次涡旋振荡。

当麦氏比浊标准匹配后，让接种物静置15分钟，以使较大的细菌团块沉降。接着，使用浊度计（nefi TER）测量悬浮细菌的密度并调零。该浊度计（nephi ter）。

首先将一支空白的生理盐水珠对照管放入 Nephi ter 中。按下校准按钮以将仪器归零，然后将 McFarland 0.5 标准管放入 Nephi ter 中，再次按下校准按钮。仪器校准完成后，取出 McFarland 标准管，插入待测菌悬液。

接种物的浊度应与麦氏比浊标准相当。如果浊度太低，则取出试管，从平板上转移更多细菌，然后涡旋混匀并再次测定样品浊度。

如果读数过高，向管中加入吐温生理盐水，涡旋混匀，然后再次读取样品。根据需要继续调整接种物，直至细菌浓度与麦克法兰标准相符。

接下来，使用200微升移液器和长型抗气溶胶移液吸头，从试管上三分之一处吸取100微升接种物。为避免沉淀至底部的团块，将接种后的Middlebrook 7H9肉汤缓慢涡旋振荡20秒，以混匀接种物。首先，将微孔板从生产商的包装中取出。如果干燥剂呈蓝色或铝箔包装有破损，请勿使用。

该板已预先在每个孔中包含待测试的12种抗菌药物，包括最有效或一线药物及二线药物。小心地将7 H九肉汤接种物倒入trth中，注意避免产生气溶胶。然后将微孔板放置成标签朝外，如图所示，并使用12通道移液器向每个孔中加入100微升接种物。

接下来，准备用于菌落计数的平板。首先，通过将阳性对照孔中的样本用一微升接种环转移至标记为1:1的七H 10平板，制备未稀释的平板。然后使用该接种环按图示方式对平板进行划线接种。

接下来，为制备1:50稀释液，从阳性对照孔中取出一环（1微升），混入含有50微升水的试管中并轻轻旋转混匀。取该稀释液1微升，接种至标记为1:50的平板上。使用移液器将50微升接种物从trth中转移至相应标记的血琼脂平板和7H10平板，通过划线法接种以获得单菌落。

然后将另一块trth叠放在已接种的trth上，并轻轻放入废弃容器中。在微孔板上贴上粘性封膜，再用白色背衬用力按压每个孔，以确保密封充分，且无褶皱。

使用结核杀菌消毒剂浸湿的纸巾擦拭微量滴定板进行消毒。然后将微量滴定板放入塑料袋中，并用热封机封口。最后，使用结核杀菌消毒剂擦拭所有材料，包括尼菲尔瓶、滤膜涡旋仪、培养板和试管，进行消毒。

此处使用Pro喷雾，需等待足够时间以确保消毒效果，Pro喷雾作用时间为15分钟。将培养皿用透明胶带封好，放入塑料袋中，并将已密封的物品从生物安全柜中取出，置于传递窗内。

此时，将装有废弃物的红色袋子用扭结扎带封口并密封，脱去防护服、鞋套和手套。随后进入缓冲间，洗手后取下呼吸器，再次洗手并对其进行消毒后存放，穿上洁净的防护服，离开三级生物安全实验室。接下来，对废弃物容器进行高压灭菌处理。

随后，将微孔板以及七块H 10和血液增菌板正置放入35至37摄氏度、含5%至10% CO2的BSL-2实验室培养箱中孵育。此操作是可接受的，因为这些板已密封良好并置于塑料袋内。结核分枝杆菌的代时约为12至24小时，因此至少需要一周时间才能观察到菌体生长，表现为对照孔底部形成细胞沉淀。在第10天，通过将密封的AST微孔板放置于镜面读数箱的平台上，进行人工镜面读数。

使用台灯以帮助观察生长情况，并根据需要调整，以获得最佳对比度。通过观察镜面检查此生长对照孔，即 H 11 和 H 12。如果存在生长，孔内将呈现浑浊或出现沉淀物，如此处所示。

如果未出现生长，如本示例所示，孔内将呈现澄清状态。此时，将培养板放回培养箱中，继续培养至多21天。针对每种条件，均需与对照组进行生长情况的比较。

那么，对于每种药物记录，首次未出现生长的稀释度即为该药物的最低抑菌浓度（MIC）。要使用自动化酶标仪（如 Vision）分析结果，首先打开 Myco TB a ST 板软件并登录，将密封的微孔板放入仪器，条形码朝外，如图所示。在计算机屏幕上，生长情况表现为浊度，或微孔底部出现细胞沉积物。

首先，检查生长对照。方法同前。如果生长结果为阴性，则将培养皿放回培养箱中，继续培养最多21天。

如果结果为阳性，则通过点击屏幕上每种药物第一个未显示生长的孔来记录结果。在某些情况下，细菌、沉淀物或药物会沉淀至孔底。这种现象称为拖尾现象，表现为多个孔中出现大小相同的沉淀颗粒，实际上并不视为阳性生长。

接下来，观察七块 H 10 培养基和血琼脂平板，以确定细菌浓度并评估纯度。血琼脂平板在培养 48 小时后应无任何菌落生长。若血琼脂平板上出现菌落生长，则表明存在快速生长细菌的污染。

如果有菌生长，则必须重复进行微量滴定板试验。七块 H 10 纯度平板应仅有一种微生物生长。EM 型结核分枝杆菌菌落应呈浅黄色、皱褶状且粗糙。若发生污染，需从纯培养物重新进行微量滴定板试验。

为评估细菌浓度，请计数七号 H 10 平板上的菌落。然后根据随附书面文件中的表格，计算菌落计数。结核分枝杆菌由患者标本培养获得，其抗生素耐药性评估方法如本视频所述。在图示平板中，共包含 12 种不同药物，每种药物浓度递增，最高浓度位于平板上方，最低浓度位于下方。

药物的最低抑菌浓度（MIC）由未显示任何细菌生长的最低药物浓度指示，该浓度在此处所示图像中已用圆圈标出，所依据的是临床与实验室标准协会（CLSI）制定的标准折点。此处数据显示，该结核分枝杆菌菌株对异烟肼和利福平具有耐药性。体外实验中，多种其他药物也显示出较高的MIC值，包括乙胺丁醇、莫西沙星、链霉素和利福布汀，提示该耐多药结核分枝杆菌菌株对这些药物亦具有耐药性。

结核病专科医生应结合MIC结果，为患者制定个体化的治疗方案。熟练掌握该技术后，对单一分离株进行实验设置约需40分钟。在操作过程中，必须牢记结核分枝杆菌是一种呼吸道病原体，操作时可能产生气溶胶。观看本视频后，您应已充分了解如何采用微量肉汤稀释法进行结核分枝杆菌的抗菌药物敏感性试验。切记，操作结核分枝杆菌具有极高危险性，必须始终采取必要的预防措施，例如使用呼吸防护设备。