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从一个含有硅基质的培养皿开始,该基质具有多个连接进样口和出样口的小通道。
通过入口注入具有排斥活性的测试蛋白,以填充通道。
孵育以使蛋白质在通道区域附着,形成测试蛋白区,然后洗涤。
移除基质,用具有趋化活性的对照蛋白覆盖包被区域,并进行孵育。
这有助于对照蛋白结合到测试蛋白区域之间的空白区域,形成交替条纹状的对照蛋白区域,然后进行洗涤。
加入层粘连蛋白以包被条带区域,然后洗涤。
将海马神经元的单细胞悬液接种至包被区域,并进行培养。
在测试蛋白区域,神经元与蛋白质相互作用,触发信号,导致神经元相互排斥,抑制其附着。
相比之下,对照蛋白质区域中的神经元-蛋白质相互作用促进神经元黏附,并支持其生长和轴突延伸。
在 PBS 中制备荧光标记的重组蛋白。每个条带培养皿制备 25 微升。将混合物在室温下孵育 30 分钟。接着,对于每个培养皿,用 25 微升稀释后的蛋白溶液装填一支 22 号针头的注射器,并通过基质侧面的小孔注入。
避免将气泡注入基质中,因为气泡会干扰蛋白质与疾病靶点的结合。
现在,将培养皿置于细胞培养箱中,在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后,向每个基质的顶部狭缝中加入300微升PBS。然后,从每个基质侧面的小孔中吸出PBS,以去除所有未结合的重组蛋白。注意不要将PBS完全吸干,以免蛋白干燥。
用 PBS 总共冲洗三次。接下来,小心地从每个培养皿中取出基质。然后,立即在整个条带区域上加入约 100 微升的对照蛋白,使每个培养皿形成交替的包被层。
接下来,将培养皿在37摄氏度下孵育30分钟。同时,将层粘连蛋白在冰上用PBS以每毫升20微克的浓度解冻。30分钟后,用PBS洗涤培养皿三次。然后,每皿加入约100微升冷的层粘连蛋白进行包被,并将培养皿放回培养箱中继续孵育1小时。
一小时后,用 PBS 将培养皿再清洗三次。第三次清洗后,向每个培养皿中加入约 150 µL 培养基。然后将培养皿置于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中孵育,直至下次使用。使用血细胞计数板对细胞进行计数,并将 10,000 个神经元接种到每块预先制备好的条纹培养板的 150 µL 培养基中。小心地将细胞悬液滴加至条纹区域,使其完全覆盖整个条纹区域。