transgenic Drosophila melanogaster 中 cis-调控元件（CRE）活性的定量比较

本实验的总体目标是定量测量在黑腹果蝇变态发育过程中起作用的顺式调控元件（CIS regulatory elements）或调控元件（CRE）的基因调控活性。首先采用位点特异性整合方法，建立将CRE作为报告转基因整合的转基因品系。使用体视显微镜获取处于正确发育阶段的转基因样本。

从外侧酒馆中取出标本，将其置于玻璃显微镜载玻片上，通过共聚焦显微镜分析，对整体封片样品中荧光报告蛋白的表达水平和模式进行记录。最后，使用 Image J 软件工具对所记录的共聚焦图像中荧光报告蛋白的表达水平进行定量分析。

这些结果为辅助调控元件赋予了一定水平的基因调控活性，有助于进一步开展针对修饰后顺式调控元件（CRE）版本的比较性基因表达研究。该方法可帮助回答基因调控领域的关键科学问题，并加深对基因调控机制编码方式的理解。DNA 相关研究与发育生物学和进化生物学密切相关。

该实验方案旨在研究在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）变态发育过程中发挥作用的顺式调控元件。然而从原理上讲，该方法也可应用于其他发育阶段或其他果蝇物种，甚至其他模式生物中发挥功能的顺式调控元件。为扩增转基因品系，需每隔一天设置两个培养瓶，每个瓶中放入若干雄性和雌性果蝇。

将果蝇从其中一个试剂瓶转移到新试剂瓶中，每周重复此操作。两周结束时，确认转基因果蝇涵盖从幼虫到成虫的各个发育阶段。

在三龄幼虫阶段末期，当肠壁（ER）形成时，开始对样本进行分期。注意此时样本已无活动能力。肠壁呈柔软的白色，球形结构已发生偏转，以此确定该时间点。

在0小时成体后（zero HAPF），通过观察位于身体中段两侧的透明圆形性腺来区分雄性和雌性，以此作为基于变态长度的分期依据。在0小时成体后，使用湿润的画笔将样本转移至新的小瓶中。

加入一片擦拭纸，并用水润湿以防止样品干燥。随后将小瓶在 25 °C 下孵育至所需的 HAPF。或者，可根据随附文本中详述的若干形态学标志物的存在与否及其位置，对样品进行分期分类。

用实验室胶带将一片封箱胶带粘贴到解剖板上，胶带的粘性面朝上。润湿一把画笔，并用该画笔为标本添加水分。将标本转移至无尘纸巾上。

将样本转移至封口袋胶带上，腹面朝上粘贴。让样本干燥15分钟。使用镊子逐步打开ER。

从头部或前端开始，向后端移动。然后将幼虫转移到载玻片上的一滴粘性油中，通过显微镜对整体封片标本进行观察。可使用 Forex 物镜或 10 倍物镜将标本调至清晰对焦。

使用共聚焦显微镜软件，调整目标荧光蛋白的激发波长，以防止光漂白。激光强度初始设置为5%至10%。如果信号较弱，则根据需要逐步增加强度，以提高信噪比。对于共聚焦图像，启用软件设置以对重复扫描的像素测量值进行平均处理（例如卡尔曼平均），用于CRE活性的定量比较，并在荧光信号最强的横截面（C-section）进行分析。

切换至饱和度警告查找表，并调整通道电压增益和偏移，使极少像素达到饱和。如有必要，调整共聚焦针孔。确定最佳设置后，运行ZS扫描以获取沿Z轴的一系列图像。

扫描完成后，将图像堆栈转换为投影图像，并将该图像文件以 TIF 格式保存。为定量比较 CRE 活性，所有重复样本及报告基因转基因品系均需使用相同的共聚焦设置。使用 Image J 程序进行实验时，首先打开一个待评估的 TIFF 图像。

单击自由选择工具按钮，勾勒出需要进行定量分析的样本区域。要获取像素值统计结果，请单击“分析”选项卡，然后选择“测量”。从结果框中记录平均像素值。

同时从CRE不活跃的背景区域采集第二个平均像素值。为获得校正后的平均像素值，继续对重复样本生成像素值统计结果。然后基于这些重复样本的校正平均像素值，确定A CRE的平均调控活性，并计算平均值的标准误差。

本实验利用白色拯救眼表型的强度来获得纯合的转基因品系。实验采用具有A TTP着陆位点序列的白色基因突变遗传背景，以实现位点特异性转基因整合。通过整合的mini white基因拷贝数，可根据眼色拯救表型的强度区分杂合子与纯合子转基因个体。

通过交配具有最深眼色表型的雄性和雌性果蝇，建立纯合品系。在果蝇从幼虫蜕变为成体果蝇的过程中，利用形态学标记来确定其变态阶段。该样本会经历一系列典型形态变化，可用于鉴定性别并大致判断其发育阶段。此处。

一个被称为双态元件的野生型A CRE可在雌性puy的ASIC腹部节段驱动EGFP报告基因的高水平表达。研究发现，该CRE内一段13个碱基对的序列是DSX转录因子的结合位点，通过量化该结合位点突变后CRE的调控活性，可证明该序列在体内的功能重要性。定量分析表明，在本研究所用的转基因插入位点背景下，该DSX结合位点的突变使调控活性降低至野生型表达水平的28±3%。

类似的比较可用于评估种内CRE等位基因之间的调控活性，或来自不同物种的同源CRE之间的调控活性，例如与雌性节段中EGFP的表达水平进行比较。由D. melanogaster胃部Cain S品系的同源CRE驱动时，D. stimulants和D. willistoni物种的六号片段其调控活性分别为75±4%和0±0%。后续可结合RNA干扰等方法作用于转录因子基因，以进一步探究这些转录因子基因如何与CYS调控元件相互作用。

这将通过由 CIS 调控元件在发育后驱动的荧光报告蛋白表达的上升与下降而得以体现。该方法为基因调控领域的研究人员探索顺式调控元件基序及其进化突变对基因表达的功能重要性奠定了基础。