发育中皮层网络的功能性钙成像

本视频的总体目标是演示如何利用钙离子敏感型荧光指示剂，测量发育中皮层脑片的神经网络活动。DY脑片取自幼鼠发育中的肠皮层。神经元和星形胶质细胞均被加载了钙离子依赖性标记物。

钙依赖性染料荧光的变化反映了细胞活动的变化。可使用特异性标记染料对非神经元细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞）进行染色。通过延时多光子成像记录皮层网络活动，并通过对感兴趣区域进行三维图像堆栈扫描来识别网络中的细胞。

随后可分析多个细胞的细胞荧光变化，以读取发育中皮层网络的活动情况。发育中神经系统的典型活动模式是自发性同步网络活动。这种同步活动已在多种不同的发育中神经元区域中观察到，包括完整的脊髓皮层以及解离的神经元培养物。在自发活动期间，神经元去极化并产生单个动作电位或动作电位簇，激活包括电压门控钙通道在内的多种离子通道，导致钙离子内流。

利用场电极或多电极阵列已可从局部神经网络中检测到高度同步的活动。这些方法能够实现较高的时间采样率，但由于对细胞活动进行的是整合性记录，因此空间分辨率较低。通过单细胞膜片钳电生理技术记录单个神经元的放电频率，可以实现对神经活动的单细胞分辨率观测。

然而，从神经网络中进行测量的能力受限于同时记录的神经元数量，通常仅为一到两个神经元。利用钙依赖性荧光指示剂染料，现已能够测量细胞网络中同步发生的活动。该技术兼具高空间分辨率和足够的时间采样能力，可用于记录发育中神经网络的自发活动。

荧光钙离子敏感探针（如URA 2:00 AM乙酰氧基甲酯）含有能够结合钙离子的羧酸基团。这些荧光染料可通过单光子或双光子显微镜在特定波长的光照下被激活。当钙离子与染料结合时，其发射的光子数量会发生短暂改变。

光子数量或荧光的这一变化被报告为ΔFF信号，对应于神经元内钙水平的变化。对钙敏感指示剂变化的测量是评估发育中细胞网络活动模式的一种有用读出方法。您好，我是Rianna Morty，我是Julie Abbots。

我们来自阿姆斯特丹大学的解释性神经生理学系。我们一直采用钙成像技术，结合多焦点成像和钙敏感探针，研究小鼠大脑皮层发育过程中组织的功能活动。本短片的目的是展示如何利用这些方法来检测神经系统发育网络中的自发性活动和诱发性活动模式。

快速从小鼠颅骨中取出脑组织，以减少对神经环路的损伤。在冰冻的切片溶液中解剖分离脑组织。该切片溶液中含有氯化胆碱，以替代常用于神经元记录的任氏液（aCSF）中的钠离子。

在这些实验中，我们正在制备发育中 小鼠 脑的肠皮层脑片。在培养皿上放置一张滤纸，并用几毫升 A TSF 润湿。将脑组织转移到滤纸上。

使用单刃剃须刀片将半球切开。分离两个半球，将其中一个与剩余的半球放回冰冷的切片溶液中。

用剃刀去除小脑。将一侧半球翻转至其内侧面向上，从背侧表面切入，刀片略朝向头端倾斜，切口深度约为一毫米。将脑组织翻转过来。

使用棉签和金属解剖刀切取其新鲜切面。将脑组织转移至金属切块板上。用棉签轻轻将脑组织从解剖刀上推至粘附表面。

对于幼年组织，脑组织切片厚度为300微米，切割速度和刀片频率通常比成熟组织更慢。切片完成后，使用玻璃移液管将每一片切片转移至孵育室中，孵育室内含有室温的含氧人工脑脊液（A TSF）。该A CSF溶液中的镁钙浓度比高于常规A CSF溶液。

用于记录的脑片需放置一小时以恢复。为了用钙依赖性指示剂或细胞特异性标记物对细胞进行染色，需要将脑片转移至染色用孵育 chamber。尽管有商用的孵育 chamber，但使用常规实验室设备即可轻松组装，成本极低。

要制作一个染色孵育盒，您需要以下基本实验设备：两个塑料培养皿、一个10毫升注射器、一段硅胶管、一个带有半透膜的细胞培养小室、速干胶、三个小型管路连接头以及一根细针。取较大的培养皿，用加热的金属棒在其侧壁上烫出一个小孔。取较小的培养皿，打一个直径相近且足够让硅胶管穿过的孔。

将一段硅胶管穿过小培养皿上的孔，并在皿内形成一个环。使用超级胶水密封管子的开口端，然后将剩余的管子粘贴到小培养皿的内壁上。

将小培养皿置于大培养皿中央并用胶固定。取硅胶管剩余的一端，从培养皿侧壁的小孔中穿过。用细针在培养皿内的硅胶管上刺出若干小孔。

以均匀间隔打孔，以实现均匀的气体交换。使用加热的手术刀取一个带半透膜的细胞培养小室，切去小室顶部约一厘米的部分，留下一个浅皿，用于在孵育期间承载组织切片。

将浅碟置于大碟中央，周围用多孔硅胶管包围。在大碟盖子上打一个直径约0.5至1厘米的孔。使用加热的手术刀取一个10毫升的塑料注射器。

以一定角度剪切，切掉注射器末端。将瞬间胶涂抹在注射器管的切面上，直接粘合到大号培养皿盖的孔洞上。

将管路连接器安装到注射器尖端的末端。将浅盘置于小型培养皿中央，确保多孔气体管路环绕浅盘放置。然后将此管路连接至碳氧混合气体供应装置，以对脑片进行氧合。

孵育期间，盖上大培养皿的盖子，该盖子也通过针头直接连接至气体供应装置。这样可在孵育过程中向脑片持续供应碳酰气体，以防止染料褪色。所有操作均在尽可能避光的条件下进行，染料和脑片均需避光保存。

从切片持有器中向染色室加入约1.5毫升A TSF。将界面室放入其中，并再加入1毫升A TSF。维持充足的氧气供应至关重要，以保持组织健康并确保切片的良好加载。

染色过程在约35摄氏度下进行，以促进染料进入神经元，同时染色室正在升温。准备用于fira 2:00 AM Ester的指示剂染料。在一支50微克的试剂瓶中加入九微升DMSO和一微升onic acid。

DMSO 和油酸。作为渗透剂，使染料能够通过脂质膜。涡旋小瓶15分钟，以确保染料完全溶解。

染色时，将每个切片转移至界面处，放入染色盒中。将染料直接滴加到切片上方的目标区域，盖上染色盒的盖子。

根据所使用小鼠的年龄，将脑片在避光条件下孵育20至40分钟。孵育结束后，将脑片转移回切片储存槽中，以洗去残留的过量染料。钙成像的染色方案也可适用于较年老的组织。

这需要额外的预孵育步骤。将旧切片转移至一个浅的预孵育皿中，皿内含有3 mL人工脑脊液和8 µL浓度为0.5%的Crema四溶液，在35°C下加热3分钟。然后将切片转移至界面，插入染色室，并按照常规染色程序进行操作。

也可以对这些切片中的非神经元细胞进行染色，即星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞。可使用硫黄素 1 0 1 对星形胶质细胞进行硫黄素染色。配制 10 µM 的溶液，将紫色染料滴加到切片中目标区域上。

孵育15分钟。将切片转移回孵育室，以去除多余的染料。番茄凝集素的FSE偶联物可对小胶质细胞和内皮细胞进行染色。

对于番茄凝集素，配制浓度为20微克/毫升的溶液。将染料滴加至切片中目标区域。将切片置于室温下孵育45分钟。

然后再次将切片转移回孵育室。成像过程中，切片需要在显微镜下保持稳定。通常使用金属固定网压住组织，但这种方法可能不均匀地扭曲切片表面，导致只有有限的视野范围处于聚焦状态，应尽量避免。

使用聚乙烯或PEI溶液将这些切片固定在记录室中。PEI是一种聚合物，可增强细胞在表面上的贴附，作用时间至少为一小时。在将切片放入记录室之前，先向记录室中加入几毫升PEI溶液，以覆盖室底。

首先，用蒸馏水冲洗掉腔室中的PEI，随后用CSF溶液冲洗。将一片组织转移至记录腔室中，并去除多余的CSF溶液。使用精细的画笔将组织片置于腔室中央位置。

使用小块的吸水滤纸吸除切片周围残留的所有人工脑脊液（A CSF）。注意确保切片边缘无任何人工脑脊液残留。最后，将半毫升人工脑脊液（A CSF）轻柔地滴加到切片上，注意不要使切片从孵育 chamber 中松动。

将室置于大型充氧的界面容器中，并在暗处再放置一小时。可使用单光子或双光子显微镜记录钙敏感指示剂染料的变化。我们采用与奥林巴斯显微镜耦合的钛蓝宝石激光器，以实现神经网络中的双光子成像。

此外，我们使用 L Vision Biotech 的切片显微系统，配备 EM CCD Hammer MATSU 相机，以提高帧扫描速率。将脑片置于显微镜下的切片室中，持续灌流含 1.6 毫摩尔钙和 1.5 毫摩尔镁的氧合 A-T-S-F-A-T-S-F 溶液。在装置中利用白光将溶液加热至约 30°C。

在切片中定位目标区域，并聚焦于表面。关闭光源并关上记录柜门，以降低背景光水平。

目前有多种不同的商业或开源软件包可用于图像的采集与分析。在本实验室中，我们使用 Lavis Biotech 提供的 inspector 软件进行图像采集。开始成像时，选择用于检测的 CCD 相机模式，并设置与您的指示剂相对应的波长。

对于 fira 2:00 AM Ester，我们在 trim scope 软件中将激发波长设置为 820 纳米。选择 64 B 扫描模式。为您的感兴趣区域选择最佳的视野尺寸和像素分辨率。

根据图像采样需求选择合适的帧率和是否启用像素旋转。打开激光快门，准备进行连续成像。使用连续成像模式。

调节增益和激光强度，并聚焦到需要成像的神经网络。停止扫描。选择延时成像的帧率和序列持续时间设置。

完成延时成像后，以1微米为步长，采集目标位置上方20微米至下方20微米范围内的Z轴层扫图像。该Z轴层扫图像用于分析过程中的细胞检测。将记录的文件导出为TIFF图像序列。

总之，我们展示了利用钙离子指示剂来测量发育中皮层的同步自发性网络活动。有关该方法和试剂的更多细节，可在随本视频提供的数据表中找到，以帮助您在自己的实验室中建立该技术。