可重复的小鼠坐骨神经挤压损伤模型及通过完整肌肉标本分析评估再生 关键词：小鼠，坐骨神经，神经挤压，神经再生，完整肌肉标本，神经功能评估

本实验的总体目标是展示一种简单且可重复的坐骨神经挤压损伤及损伤后肌肉再神经支配的全组织染色分析方法。首先暴露坐骨神经，合理安置手术拉钩以充分显露神经，确保操作视野清晰。随后使用止血钳对神经进行挤压损伤，并用炭粉标记损伤部位。

然后，从后肢分离出由坐骨神经支配的单个肌肉。最后一步是在免疫染色后对单个肌肉进行解剖，以进行全装片分析。最终结果表明，可重复的坐骨神经 crush 损伤可简便地实施，并且肌肉全装片可用于分析其后的再生过程。

该方法的主要优势在于提供了一种简单且可重复的坐骨神经 crush 损伤技术，并可随后对轴突再生进行评分。开始操作前，通过腹腔注射给予小鼠麻醉，麻醉剂为氯胺酮（100 毫克/千克）与赛拉嗪（10 毫克/千克）的混合溶液，以减轻术后疼痛。同时，小鼠还需皮下注射美洛昔康 10 毫克/千克。

接下来，使用手术剪仔细剃除两侧后肢的毛发。然后涂抹鼻部脱毛膏以彻底清除毛发。用无菌棉签蘸取聚维酮碘外科洗手液清洁皮肤。

之后，使用无菌棉签将眼用软膏涂抹于小鼠眼睛。将小鼠置于预热的恒温毯上的一块洁净不锈钢板上，并维持动物体温在37摄氏度。然后用胶带固定所有四肢。

将后肢小心地对称放置，使膝关节与身体呈直角。随后，在显微镜下用无菌手术巾覆盖手术区域。沿中线做一弧形切口。

轻柔地将皮肤与下方的肌肉组织分离，并不时将其折叠翻转。手术过程中，滴加约 0.1 毫升无菌生理盐水以保持手术部位湿润。接着，切开臀大肌与股二头肌前头之间的筋膜平面。

暴露坐骨神经以进行手术对照。应暴露对侧坐骨神经并加以游离，但保持其完整。随后复位并缝合臀肌。

使用拉钩以相同方式暴露实验侧坐骨神经，以利于观察。用虹膜剪轻轻分离坐骨神经周围的结缔组织。

然后使用精细的 5 45 号镊子将神经放置在超精细止血钳的下颌底部，使三个束膜并排相邻排列，不可重叠。止血钳在其尖端 1.5 毫米处已刻有标记。在进行挤压前，将坐骨神经最外侧部分与该标记对齐。

这可以确保压榨部位宽度均匀，并且在受压榨力作用而变扁平时，神经不会超出止血钳的钳口。如果神经超出钳尖，将只能部分压榨。使用另一把预先蘸过并涂有碳粉的止血钳标记压榨位置。

在同一处神经压迫位置以三下点击进行压迫，持续15秒。碳标记不应超出初始压迫边界的范围。如果需要精确定位压迫位置，则这一点尤为重要；此时应在术前将镊子浸入碳粉中，并避免在手术部位出现广泛的碳沉积。

将镊子在粉状碳中打开，然后轻轻闭合。用无菌纱布擦去止血钳外表面的碳粉。

在至少三倍放大镜下检查镊子，以确认压碎表面均匀地涂有碳粉。如有必要，需重新蘸取并擦拭。以与对侧相同的方式缝合臀部肌肉组织。最后，使用9毫米的自动缝合夹关闭皮肤切口。

若发现9毫米反射夹限制了活动，可使用较小的反射夹或6-0自体缝线。相反，在处死小鼠后，通过将其结缔组织固定于黑色Sylgard包被的培养皿中，仔细分离后肢的四块肌肉：胫骨前肌、趾长伸肌、腓骨长肌和比目鱼肌。

然后用 PBS 冲洗。随后在 4%多聚甲醛中固定 30 分钟。在黑色硅化涂层培养皿上解剖每块肌肉，使用虹膜剪去除肌腱。

随后，通过剥离内部肌纤维来使肌肉变薄，注意小心保留肌肉的外表面，包括终板带。然后将处理后的肌肉置于载玻片上，使用Vector Shield封片剂，并用22 mm × 40 mm的玻璃盖玻片覆盖，再用透明指甲油密封两侧。当肌肉正确安装在载玻片上时，终板带应与盖玻片接触。

这是左后肢原位压伤部位的一个示例。压伤部位由黑色炭粉标记。星号标记的是支配大腿肌肉组织的胫神经分支，可作为有用的解剖标志。

在压榨手术过程中，坐骨神经的胫神经分支用蓝色标出，腓总神经为绿色，srel 为黄色。该半薄切片显示了使用止血钳完成的完全压榨。箭头指示此处被压榨的神经纤维。

在另一处半薄切片中可见使用斜角镊子进行的不完全挤压。箭头再次指示被挤压的纤维，而箭头指示保存完好的轴突。这些是来自整体肌肉标本的成像图像。

在去除结缔组织并进一步减薄后，每块肌肉上的 nplate 条带被勾画出来。图中所示为坐骨神经 crush 损伤后 14 天的完整肌肉铺片。

箭头指示了由轴突重新支配的神经肌肉接头区域。此处展示了去神经支配的神经肌肉接头。箭头所示为 Gap 43 阳性的施万细胞突起。

在此去神经支配的神经肌肉接头中未见任何轴突。观看本视频后，您应能够充分理解如何可重复地压榨静止神经，并制备肌肉标本以用于再生过程的分析。