基于图像的 Tali 细胞仪评估 GFP 表达与细胞活力

本视频演示了使用基于成像的 Tally 细胞计数仪测定表达 GFP 的细胞活力的方法。将经 GFP 转导的细胞使用 Tally 活力检测试剂盒中的死细胞红色染料（含碘化丙啶）进行染色，所有死细胞均被染成红色；随后将细胞悬液移入 Tally 细胞分析载玻片中，并加载至细胞计数仪。该仪器采集并分析明场、红色荧光和绿色荧光图像，生成直方图以显示细胞数量、细胞大小、碘化丙啶荧光强度以及 GFP 荧光强度，结果可与传统流式细胞术进行比较。

Tali 可提供与细胞活力和表达相关的类似数据。然而，这种基于图像的细胞计数技术可提供关于待测细胞群体的额外视觉信息。与现有的流式细胞术或荧光显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于，Tali 基于图像的细胞计数仪可同时提供关于细胞样本的定量和视觉信息。

此外，计数仪比流式细胞仪或荧光显微镜更易于使用、成本更低且占用空间更小。这使得研究人员能够在实验台上快速进行定量检测，例如对表达GFP的细胞进行活力分析。在此实验步骤中，将浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升的U2 OS细胞用靶向细胞核的CellLight GFP病毒载体进行转导，以持续标记死亡细胞；随后加入碘化丙啶，将100 µL细胞悬液转移至新的微量离心管中。

请注意，建议检测时细胞浓度为每毫升1×10⁵至1×10⁷个细胞，但浓度无需完全精确。接下来，加入1 µL的Tally Dead Cell Red试剂。然后短暂涡旋混匀，将染色试剂与细胞混合物在室温避光条件下孵育1至5分钟。

孵育结束后，立即在基于计数图像的细胞计数仪上进行分析。该计数仪使用专为该仪器设计的一次性塑料细胞分析载片。加载载片时，务必始终捏住载片边缘。

将25微升样品缓慢移液至其中一个半月形加样区域。此处，未染色的非转导对照细胞加样于A室，而染色的表达GFP的细胞加样于B室。如需在表达GFP的细胞中进行活力检测，请触控细胞仪主屏幕上的G-F-P-R-F-P。随后在右侧出现检测选项，选择GFP加活力检测。

仪器将提示是否需要为样本系列命名。请按“立即命名”。然后使用触摸屏输入样本系列的名称，并按“保存”，计数仪将自动进入测量界面。

接下来，为了测量背景荧光，请按下测量界面右下角的“背景”标签，如图所示。默认设置为将拍摄九个视野的细胞图像。现在，将对照样品朝向远离仪器的方向，将载玻片插入加载口直至无法继续推进。

请勿用力按压背景屏幕以插入新的未染色细胞对照。载玻片将自动被拉入仪器中，细胞的实时图像将显示在屏幕上。使用调焦旋钮，在聚焦的同时将细胞调整至合适的观察平面。

将红色缩放按钮滑动至 4 x 或 16 x。为了更清晰地观察细胞群体，细胞应呈现均匀的深色，每个细胞周围有明亮的光晕。如图所示，当背景与细胞边缘之间的过渡模糊，导致细胞边界不清晰时，可能导致细胞计数偏低。

当细胞具有明亮的中心和较暗的边缘时，可能导致细胞计数偏高。一旦将细胞调至清晰对焦，轻触并按压以运行未染色细胞对照。为测量背景荧光，流式细胞仪将自动捕获图像，并显示每个视野的缩略图。

进度条可实时更新分析进程。图像采集完成后，细胞仪会自动弹出载玻片，并提供对所采集图像的分析数据。存储的数据将显示在背景选项卡的下拉菜单中。

背景对照样本将被赋予与实验相同的名称。要运行经PI染色的GFP转导样本，请将载玻片从仪器中取出，翻转后重新插入，使转导样本面背向仪器。按下样本标签，然后触摸按压以插入新样本。

当图像出现在屏幕上时，使用调焦旋钮将细胞调至清晰。与之前相同，然后触摸按压以运行样本。图像采集完成后，分析数据将显示在样本标签下，细胞计数仪会自动适当地弹出载玻片。

将计数细胞分析玻片作为生物危害性废弃物处理，这些玻片不可重复使用。样本运行完毕后，可对样本应用阈值。

为了分析此处的特定细胞群体，我们将调整阈值以确定活细胞和死细胞的百分比。在样本标签页的 GFP 表达细胞中，将显示表达 GFP 的活细胞数量和百分比、表达 GFP 的死细胞数量和百分比、总活力。同时显示平均细胞大小、计数的细胞数量以及细胞浓度。

此外，屏幕底部会显示细胞大小、绿色荧光和红色荧光的直方图。要设置细胞大小门控，请触摸细胞大小缩略图以打开细胞大小直方图，从而排除任何碎片。移动蓝色滑动条，以排除过大和过小的事件。

点击以选中门控范围内的细胞。接下来，要将GFP荧光加入分析，请点击GFP直方图缩略图以打开它。

移动蓝色滑块条，将阈值设置在最微弱峰的右侧。以对照样品作为参考。这样可使分析包含 GFP 阳性细胞，同时排除自发荧光细胞。

当细胞内的生物分子被激发时，常会观察到自发荧光现象。轻触“确认”并返回上一屏幕。此时，样本标签页下显示的数据应已反映为两个荧光通道所设置的门控和阈值。接下来，为了将PI染色的细胞与样本中的自发荧光或任何背景信号区分开，可点击PI直方图缩略图以再次打开它。

对照样品的峰将以灰色峰形显示在直方图上。红色峰代表样品的荧光信号。背景荧光在此仪器上显示为最接近零相对荧光单位（RFU）值的峰。

为了消除 PI 通道中的背景荧光，请移动蓝色滑动条以调整阈值。为排除此峰，请以对照样本的灰色峰作为参考。当 PI 通道中的阈值设置适当时，点击“应用”以确认并返回上一界面，计数仪器将再次自动重新分析数据，并在样本标签页中更新结果。

接下来，为了直观确认每个细胞都被正确分配，请按下缩放选项卡，然后通过点击图像的缩略图来选择一个已捕获的视野进行查看。接着按下图层选项卡。随后，按下 GFP 或 PI 按钮，以显示通过该通道捕获的图像。

再次按下同一按钮可从显示中移除该图层，或叠加图层；触摸对应各通道的按钮，以确定细胞如何通过特定通道被计数。触摸仅通过明场通道计数的细胞，不表达荧光的细胞将以蓝色圈出。这表示特定细胞为在绿色通道中表达的活细胞。

表达于红色通道中的绿色荧光蛋白将用绿色圆圈标出。经碘化丙啶染色的死亡细胞用红色圆圈标出，并在红、绿两通道中均被计数。红绿双通道信号重叠的细胞将用黄色圆圈标出。

这表明该细胞表达GFP，但也被PI染色，因此是死亡细胞。偶尔屏幕上会出现黑色圆圈，这些是已被识别但根据细胞大小被排除在分析之外的物体。

继续使用上述步骤微调荧光直方图的阈值，直到每个表达荧光的细胞都被相应颜色的圆圈标记为止。所有分析参数将自动保存至仪器中。位于数据选项卡下。

该计数设备可存储500次样本运行的数据文件。数据标签页中存储的每个文件均可用于重新分析。通过从数据标签页中选择文件，即可重新打开，所有直方图和图层将恢复活动状态，以便归档数据并生成报告。

可使用U盘将仪器中存储的数据传输至计算机。四种代表性细胞类型被转导了带有核靶向的CellLight GFP病毒载体，并用Tally活力检测试剂盒中的死细胞红色试剂染色，随后在此处所示的流式细胞仪中通过Tally系统进行分析。两种方法报告的每种细胞类型中表达GFP的细胞百分比相近，同时报告了总细胞群中既具有活力又表达GFP的细胞百分比。

这些数据表明，Tali 流式细胞仪能够区分细胞群体中的总 GFP 表达与活细胞群体中的 GFP 表达。我们刚刚展示了如何使用 Tali 图像式细胞仪来评估细胞样品中的荧光表达和细胞活力。该技术弥合了单个细胞研究与群体细胞研究之间的差距。

利用计数图像式细胞仪，您可以获取有关单个细胞以及更大细胞群体的定量和定性视觉信息。采用相同流程，还可进行多种其他检测，包括细胞凋亡、RFP 表达和细胞活力检测。对于不表达特定标记的细胞，其潜在应用包括基因表达分析以及药物疗效研究。