样品制备 结核分枝杆菌 核磁共振代谢组学研究用提取物

本实验的目的是通过核磁共振代谢组学分析结核分枝杆菌的无细胞提取物。首先培养细菌，并在适当的生长期收获细胞。然后裂解细胞，获得用于分析的无细胞提取物。将冻干的提取物重悬于缓冲液中，用于核磁共振分析。

最后，采集核磁共振（NMR）数据，并使用软件分析谱图以鉴定代谢物。最终，通过对结核分枝杆菌进行NMR代谢组学分析，可展示在不同处理条件下代谢物水平的保持情况。NMR代谢组学可应用于结核分枝杆菌生理学的关键方面，例如重要的代谢通路。

这种理解对于阐明药物作用和耐药性的机制以及发现药物设计的新靶点至关重要。通常，初次接触该方法的研究人员会因无法完全一致地处理所有样品而遇到困难，这将引入不必要的变异以及实验室结果的偏差。我实验室的博士研究生 Steven Luka 将演示用于核磁共振（NMR）处理的样品制备步骤。此外，我实验室的研究实验室主管 Robert Fenton 与三级研究技术员将共同演示在进行结核分枝杆菌（M. tuberculosis）实验时培养结核分枝杆菌的操作流程。

研究遵循机构指南规定的生物安全三级操作规范。尽管本视频中的标签出于生物安全考虑标注为结核分枝杆菌（microbacterium tuberculosis），但本次演示实际使用的是非致病性的嗜热分枝杆菌（mycobacterium magmatic）。首先将一管含50%甘油的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌种置于冰上解冻。

将0.15毫升接种至250毫升ER锥形瓶中的110毫升M-A-D-C-T-W肉汤中，在37摄氏度、100转/分钟振荡条件下培养约六天。若无需添加抗生素、替代物或其他处理，则收获需要处理的培养物。

为培养、滴定和质量控制，预留0.5毫升Eloqua置于冰上。随后进行所需处理，并在处理时间结束后将培养物重新放回摇床。取出1毫升样品，测定OD 600。

同时，保留0.5毫升样品用于培养、滴定和质量控制。在整个后续操作过程中，始终将细胞置于冰上。用15毫升冰冻的双蒸水洗涤后，通过离心将细胞收集到四个50毫升离心管中。

将沉淀物重悬于10毫升等份溶液中。取出两份等份样品，通过离心获得沉淀，然后将细胞沉淀重悬于1毫升双蒸水中。若需获得无团块的单细胞悬液，可将细胞通过27号针头吹打。

将一毫升细胞悬液转移至含有B型裂解基质的两毫升螺旋盖管中，重复三次。将FastPrep-24裂解均质器置于生物安全柜内。将样品放入样品架中，并固定好限位辐条板。然后以每秒六米的速度处理60秒。

接下来，离心样品以沉淀细胞碎片和完整细胞。然后将上清液通过0.2微米注射器滤器过滤至无菌管中，以确保无活细胞存在。取0.1毫升样品涂布于MADC琼脂平板上。

将样品置于乙醇干冰浴中冷冻，并在负80摄氏度下保存，直至准备进行冻干并在核磁共振（NMR）设施中处理。两个月后，检查平板以确认无菌落形成单位存在。若未发现菌落形成单位，样品可从生物安全三级实验室转移至标准核磁共振设施进行进一步分析。

将样品完全干燥后，加入0.7毫升核磁共振（NMR）缓冲液重悬，并转移至微量离心管中，在13,000 × g条件下离心3分钟，移取0.6毫升上清液转移至5毫米NMR样品管中。在培养基分析中，定制的支架可协助将多个NMR样品管以正确的深度装入旋转器中。

然后将样品转移至核磁共振波谱仪，插入 A-B-A-C-S 型 20 位自动进样器中。交替放置未经处理和药物处理的样品。在自动运行开始时，第一个样品需预先装入磁体中。

为校准仪器，先使用单个样品优化90度脉冲长度，并对剩余样品调节仪器。使用图标NMR和grad shim。对每个样品自动进行锁场、匀场及NMR数据采集。

对于一维氢核磁共振谱，选择带有水峰抑制和激发塑形的脉冲序列。设置总共 32,000 个数据点，128 次扫描以及 16 次预扫描，用于二维 DH 一碳十三 HS QC 谱。选择相应的脉冲序列。

沿直接氢一维方向选择总共2048个数据点和扫描宽度，沿间接碳13维方向选择64个数据点和扫描宽度。同时设定谱图采集参数为128次扫描和16次虚拟扫描，以获得良好的信噪比。结核分枝杆菌的谱图约产生400个峰，其中包括50种已知代谢物。

例如，根据随附文稿中详述的数据处理方法，得到了与D-丙氨酸代谢途径直接或间接相关的代谢物谱。峰强度的大小与细胞提取物中代谢物的浓度成正比，因此可以在不同样本和处理之间定量分析代谢物及代谢途径的相对变化。LMR代谢组学为细菌学领域的研究人员探索细菌（包括其他致病性或非致病性微生物）的生理学和致病机制提供了新的途径。

观看本视频后，您应充分了解如何制备多种结核分枝杆菌细胞提取物用于核磁共振代谢组学分析，并且重要的是，在整个实验流程中保持操作的一致性，以获得可靠的结果。