TransFLP — 一种基于自然转化和FLP重组的对Vibrio cholerae进行遗传修饰的方法

本实验的目的是利用这种基于自然转化和Flip重组的快速且高效的方法，对紫色色杆菌进行遗传操作。首先，需要准备合适的几丁质来源，因为几丁质是自然转化的天然诱导物。在第二步中，通过两轮PCR扩增构建目标DNA片段，随后进行自然转化，使含有PBR-Flip质粒的细菌摄取PCR扩增片段，并将其整合到自身的基因组中。

接下来，通过升温诱导质粒编码的脂肪酶，以切除两侧由翻转重组靶点（FRT位点）包围的抗生素抗性盒。最后一步中，将细菌中的FLP编码质粒消除。最终通过PCR和测序验证基因操作成功。

与现有方法（例如使用自杀质粒对弧菌进行遗传操作）相比，该技术的主要优势在于其速度极快且效率很高。首先，在标准的1.5毫升塑料离心管中称取50至80毫克的甲壳素碎片，保持管盖打开状态进行高压灭菌；高压灭菌程序结束后立即关闭管盖，并将经高压处理的甲壳素碎片在室温下保存。至少需要六条寡核苷酸引物，用于通过PCR扩增目标DNA区域以及FRT侧翼的抗生素抗性盒。此外，建议包含一对位于插入PCR片段外侧的寡核苷酸引物。

这可以用于检测FRT侧翼的抗生素抗性盒（编号为二、三、四和五）的正确整合与切除。引物二和五应至少包含28个碱基对，以确保充分结合基因组DNA和引物。引物三和四应以含有FRT序列的质粒为模板进行设计；设计引物二和五时，需使其在5′端与引物三以及引物四和五之间分别具有广泛的互补碱基配对能力。

现在进行第一轮 PCR，使用引物一和引物二，对定制设计的构建体中目标实验区域上游区段进行扩增，该扩增为三个同时进行但相互独立的 PCR 反应中的第一个。与此同时，使用引物三和引物四进行第二个 PCR 反应，以扩增两侧带有 FRT 位点的抗生素抗性盒。例如，在本实验中，使用了编码抗卡那霉素抗性的 APH 基因。

同时扩增下游DNA区域，方法是使用引物五和引物六以及基因组DNA作为模板，制备第三个PCR反应。随后，在纯化全部三个PCR片段后，对所有三个样品开始PCR反应；以第一轮获得的三个片段等量混合物作为模板，进行第二轮PCR扩增。该扩增反应由引物一和引物六催化。

所得PCR片段将作为自然转化实验中的转化DNA。在30摄氏度下有氧富集培养霍乱弧菌细胞后，于室温下通过离心收集细菌。

接下来，将细菌培养物以碎片形式转移至风筝状载体上，并在30摄氏度下孵育细胞悬液过夜。随后，仔细地将至少200纳克第二轮PCR扩增得到的片段混入细菌细胞悬液中。注意不要过度剥离细菌与几丁质表面的结合，然后将此溶液在30摄氏度下静置孵育一天。

现在将含有 PBR flip 质粒的菌液剧烈涡旋振荡至少 30 秒，取 100 至 300 微升细胞溶液涂布于含有氨苄青霉素及其他相应抗生素的双选择性平板上。将细菌培养物在 30 °C 条件下培养，直至菌落可见。随后从选择性平板上分离单克隆转化子。

将细菌在含有氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上于 37 摄氏度培养 16 至 24 小时，开始此步骤。作为可选步骤，可在更高温度下解除 PBR flip 质粒中 flip 基因的抑制表达，因此可将温度升高至 40 摄氏度持续 2 至 3 小时。在 37 摄氏度继续培养 8 小时后，将细菌转移至新的新鲜平板上。

随后将克隆平行接种于含抗生素和无抗生素的琼脂平板上，以检测其对抗生素的敏感性，并分离出单个对抗生素敏感的菌落。此步骤首先在30摄氏度、有氧条件下，于不含抗生素的富集培养基中过夜培养菌液。次日清晨，将过夜培养物以1:100的比例接种至新鲜的无抗生素培养基中，振荡培养3至6小时。下午时，将培养物进行划线或梯度稀释后涂布于普通的LB琼脂平板上，随后将平板在30摄氏度继续孵育8至16小时，直至菌落可见。

在本实验中，旨在删除邻近基因 CTXA 和 CTXB。用于转位翻转法的寡核苷酸已如前所述生成。对亲本菌株、中间菌株（其基因组中 C-T-X-A-B 的原始 DNA 位点被 FRT 侧翼的抗生素抗性盒所取代）以及最终菌株（C-T-X-A-B 被完全删除且抗性盒已被移除）均进行了基因型检测。本实验通过全基因组 PCR 进行，所用引物不与转化用的 PCR 片段结合，而仅与染色体 DNA 结合。PCR 产物通过标准琼脂糖凝胶电泳分离，以确定其大小。

在泳道一中，世界B型霍乱菌株位于预期的3,143个碱基对片段大小处。在泳道二中，来自菌株delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT的PCR片段位于3,162个碱基对处。

在第三泳道中，与1 kb DNA标准相比，delta ctx A B FFR TP CR片段位于1,769个碱基对处。在第二个实验示例中，目标为完整删除一个基因组岛，选择霍乱弧菌致病岛1（Vibrio Pathogenicity island one，VPI-1）作为本实验的靶点。该实验对trans flip方法进行了两个步骤的修改。

首先，在致病岛PI一的起始位置通过一个FRT位点介导，将卡那霉素抗性基因整合进去。然后进行第二轮自然转化，使另一个抗生素抗性标记——即庆大霉素抗性基因——插入到致病岛末端，并在其后引入第二个FRT位游戏副本。每张凝胶图上方均标示了相应的引物对，随后的trans FLP方法操作如上文所示继续进行。

亲本菌株、中间菌株和最终菌株均通过第一泳道中纯化基因组DNA的PCR进行验证。野生型霍乱弧菌V cholerae菌株的PCR片段在第二泳道中电泳。VPI-1-FRT::GM-FRT菌株产生的PCR片段进行了电泳。

第 3 泳道分析了菌株 delta VPI one FRT 衍生的 PCR 产物。每张凝胶图像上方标示了引物对。最终菌株缺失了完整的 VPI one 区域。

在第三个示例中，采用略有修改的标准方案，通过 trans flip 方法将 T7 RNA 聚合酶依赖性启动子序列整合至基因 *tetR*（自然转化的主要调控因子）的上游。T7 RNA 依赖性启动子的共识序列作为突出端被包含在编号为四和编号为五的寡核苷酸中，从而使该 DNA 序列保留在染色体内部。即使在抗生素抗性盒被切除后，该构建体仍被整合到含有 T7 RNA 聚合酶的 V. cholerae 菌株中。

在该菌株中，T7 RNA 聚合酶基因的表达由 LAC UV5 启动子驱动，以检测 T7 RNA 聚合酶依赖性的 T Fox 基因表达。自然转化实验在 LB 培养基中进行。亲本菌株在目标基因 T Fox 前缺乏 T7 依赖型启动子，因此在此条件下不具备自然转化能力，这是由于在富营养培养基中且无其天然诱导物几丁质存在时，T Fox 无法转录。该表型与是否通过 IPTG 人工诱导 T7 RNA 聚合酶的表达无关。

然而，该反式翻转产生的菌株含有位于感受态基因 tfoX 上游的 T7 RNA 聚合酶依赖型启动子，在 LB 培养基中由于 lacUV5 启动子的渗漏表达，确实能够在富集培养基中自然转化。所产生的 T7 RNA 聚合酶已在未加入 IPTG 诱导的情况下，从 T7 RNA 聚合酶依赖型启动子起始转录 tfoX，从而启动了自然感受态与转化过程，证实了整合的 T7 RNA 聚合酶依赖型启动子序列具有功能活性。

由于添加了LAC UV5启动子的诱导剂IPTG，T7 RNA聚合酶的完全诱导显著增强了该表型。观看本视频后，您应能很好地掌握如何利用几丁质诱导的自然转化与Flp重组相结合的方法，对霍乱弧菌进行遗传操作。一旦掌握该技术，可在短短几天内实现基因或基因组岛的删除，以及DNA序列的位点特异性整合。