一种用于研究单纯疱疹病毒潜伏与再激活的原代神经元培养系统

本实验的目的是演示如何利用原代神经元细胞培养系统来研究单纯疱疹病毒的潜伏感染与再激活。该目标通过以下步骤实现：首先从RA胚胎中分离颈上神经节神经元，消化神经节后分离神经元，并在去除非神经元细胞后进行培养；随后，在存在裂解复制抑制剂的条件下，使用表达EGFP的病毒对神经元进行感染，从而建立潜伏性HSV感染模型。

下一步是诱导潜伏感染的细胞培养物发生再激活。最后，通过随时间监测EGFP的表达来评估再激活的效率。最终，可以获得结果，以展示不同的神经元信号通路如何通过化学抑制剂、RNA干扰和基因递送手段调控单纯疱疹病毒的潜伏与再激活过程。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对调节宿主神经元中单纯疱疹病毒森林潜伏感染的相互作用进行分子水平的详细研究。该方法有助于回答单纯疱疹病毒森林潜伏领域中的关键问题，例如：哪些信号参与抑制潜伏基因组？以及在分子水平上，再激活是如何被触发的？在神经元中，该方法可为HSV-1潜伏感染提供深入见解。

该方法也可应用于其他神经营养性α疱疹病毒。演示本实验操作的是我们实验室的两位研究生 Marigo Kochi 和 Julian Kim。本方案所用的颈上神经节（SCG）神经元取自妊娠雌性大鼠子宫中取出的 E21 大鼠幼崽。在解剖罩内操作，将每只幼鼠置于解剖盘中，剪刀对准肩部上方的颈部基部，剪下头部以处死幼鼠。为暴露神经节，使用23号针头在三个位置将头部（颈部朝上）固定。

首先固定脊髓。其次，将前部皮肤拉至鼻部上方并固定，第三步将食管和气管从颈部后方分离并固定。通过寻找颈动脉分叉来定位颈上神经节（SCG）。

颈动脉是成对的结构。颈部两侧各有一个分叉，因此每侧各有一个星状神经节（SCG）。SCG位于分支正下方。

用两端将分叉处拉开，从而将颈上神经节（SCG）与动脉分离。与包围分叉处的不透明黄色脂肪组织相比，SCG呈半透明且无色。将神经节放入12 mL的L-15培养基中。

将含有葡萄糖的培养基置于冰上的15毫升锥形管中。从胚胎中收获所有s SCGs后，轻轻离心神经节1分钟。在600 RPM条件下，去除多余的培养基Reese。

将神经节悬浮于1 mL L-15培养基中，培养基中含有胰蛋白酶和胶原酶。在37°C下孵育24分钟。

每8分钟振荡一次。随后加入10毫升海水中止胰蛋白酶反应，600转/分钟离心1分钟。尽可能吸除胰蛋白酶-胶原酶消化液，加入10毫升C培养基重悬神经节，600转/分钟离心1分钟。

重复此洗涤步骤一次。移除洗涤液，将神经节重悬于1毫升C培养基中，使用连接5毫升注射器的21号针头进行解离，最多上下吹打15次。随后换用23号针头继续吹打，直至大部分细胞团块完全解离。

通过70微米尼龙滤膜将解离的神经元过滤至50毫升锥形管中，以去除残留的细胞团块。取10微升过滤后的细胞悬液，加入台盼蓝混合，以确定活细胞数量。使用血细胞计数板计数能够主动排除染料的细胞数量。

接下来，将5,000至6,000个总活细胞加入100微升C培养基中，接种于预先包被胶原蛋白和层粘连蛋白的96孔组织培养板的每个孔内，C培养基中需含有50纳克/毫升的神经生长因子。在37摄氏度下培养过夜。次日，即体外培养第一天（DIV 1），检查神经元是否正确贴壁以及部分轴突突起的生长情况。

将孔中的 C 培养基替换为 50 微升含有 NGF、Acho 以及 5-氟-2-脱氧尿苷的神经基础培养基或 NBM。每次更换一行培养基，以确保细胞不会干燥。将培养物在 37°C 下孵育 5 天。

每天监测培养物，以确认非神经元细胞的死亡和神经元的生长。从体外培养的第6天开始进行该步骤时，需确认大部分非神经元支持细胞已被清除。在整个操作过程中，务必尽量减少对神经元不必要的物理操作。

更换培养基时操作必须轻柔缓慢，否则由此产生的机械应力可能影响神经元的存活率。向每孔现有的培养基中加入阿昔洛韦或CV，使其终浓度为100微摩尔。应缓慢轻柔地加入CV，以确保机械力不会在次日对细胞产生不利影响。

在体外培养第7天，用一种重组的表达EGF报告基因与病毒裂解蛋白US11融合蛋白的HSV-1病毒感染SCG培养物，感染复数控制在1至2之间。将稀释后的病毒直接加入孔中现有的培养基中。设置未感染的对照组和裂解性感染组。

在不含CV的培养基中设置阳性对照。在37摄氏度下孵育感染体系2至3小时。随后，将感染培养基更换为含有NGF和CV的新鲜NBM。更换感染培养基时务必操作轻柔。将培养板向自己方向倾斜，从孔底部缓慢吸出培养基。

然后将移液枪的枪头对准孔板的孔壁而非孔底，使培养基轻轻沿壁滑下，缓慢加入至细胞中。每次更换一行培养基，以避免细胞干燥。更换完成后，将培养物放回培养箱，操作过程中应尽量轻柔，以免影响细胞支持HSV-1潜伏感染的能力。

在37摄氏度下培养6天，使病毒建立潜伏感染。在此期间，使用荧光显微镜监测us11 EGFP的表达，作为裂解性复制的指标。

正如预期，空白感染对照组中不应出现GFP表达。S 11 EGFP仅应在感染组中被检测到。未进行CV处理的阳性对照孔表明初级感染成功且存在有效的裂解性复制。

为了在DIV 14评估再激活，需小心地将含有CV的培养基替换为不含CV的新鲜培养基，操作方式与之前相同。若条件允许，应将移液器枪头对准孔壁而非孔底，使培养基沿孔壁缓慢流下，轻柔地覆盖细胞。实验中应包含药理学或生物学变量，例如添加20微摩尔的LY 29004。

在经 A CV 处理的潜伏感染培养物中，不应检测到 GFP 表达。将细胞放回 37 摄氏度培养 5 至 6 天。使用荧光显微镜监测活体培养物，以检测发生再激活的神经元。

通过计算含有 EGFP 阳性神经元的孔数，并将其表示为样本总孔数的比例，来确定再激活频率。该图展示了一个示例，其中使用已知的再激活诱导剂触发素（trigger statin）处理晚期感染的 SCG 培养物。在药物处理后连续五天，每天通过荧光显微镜监测并评分再激活情况。

通过 TSA 处理，两天内再激活达到最大值的 50%，五天内再激活达到 60% 基线水平，即 DMSO 处理组所代表的自发再激活水平。本实验中，经处理的对照组培养物约为 10%，在此体外系统中通常范围为 5% 至 20%。感染后期的 SCG 培养物也用 LY294002 进行处理。

使用LY诱导的再激活培养物与使用病毒DNA合成抑制剂磷ono醋酸（PAA）处理的培养物，以及同时使用这两种化合物处理的培养物进行了比较，如图所示。在由LY294002诱导再激活的培养物中，PAA抑制了US11-EGFP的表达，表明US11-EGFP的表达依赖于病毒DNA的复制。在进行该操作时，必须严格注意无菌操作技术，并尽可能轻柔地处理CG培养物，以避免因应激或机械运动导致自发性再激活增加。在通过该方法建立HSV-1潜伏感染的培养神经元后，可进一步开展其他实验方法，如S-H-R-N-A、基因敲低以及野生型与突变型基因的异位表达，以鉴定调控HSV-1潜伏与再激活的神经元功能。

请务必注意，HSV-1 是一种人类病原体，需要采取 PSL-2 安全防护措施。在进行本实验操作前，您应熟悉在 PSL-2 条件下的实验操作规范。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立 SCG 培养体系以建立 HSV-1 的潜伏感染，并有效诱导神经元中的病毒再激活。