单病毒基因组学用于单个病毒颗粒的分离与基因组分析

本实验的总体目标是从混合的病毒群落中分离单个病毒颗粒，并对获得的基因组材料进行测序，从而在无需培养的条件下鉴定来自多种环境中的病毒。该目标首先通过流式细胞分选技术将单个病毒颗粒分离并捕获到琼脂糖微珠上实现，随后利用共聚焦显微镜验证单个病毒颗粒的捕获情况。

接下来，从病毒颗粒中分离基因组物质，并通过多重置换扩增（MDA）技术扩增DNA，以获得测序所需的足够量DNA。最后，利用高通量测序技术对病毒DNA进行测序，从而获得病毒基因组的深度覆盖，显著促进基因组的组装与注释。最终，通过采用序列子抽样策略以增加重叠群（contig）长度的生物信息学方法，可实现对分离病毒颗粒的分析。

该方法可通过为大量未注释的病毒浮游生物基因提供基因组背景，帮助解答病毒生态学领域的关键问题，同时能够从多种生态系统中发现新的基因组。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为单个病毒粒子的扩增与分离已接近当前技术的极限。我们最初提出该方法的设想，是在评估多重置换扩增（MDA）技术用于病毒浮游生物群落研究时，意识到有可能对单个病毒颗粒进行分选并测序，从而从这些复杂的群落中组装出完整的病毒基因组。使用配备定制前向散射光电倍增管（FSCPMT）的流式细胞仪对病毒进行分选。首先将病毒颗粒悬浮于0.1微米过滤的Tris-EDTA缓冲液中。对于含有T4和λ噬菌体颗粒的混合样品，将FSCPMT设为1000，侧向散射光（SSC）设为200，以最大化信噪比。

运行对照样品后，将约100微升染色后的病毒悬液上样，总计获取5,000个事件。然后利用SYBR Green I与FSC-PMT图在病毒颗粒中心设置一个严密的门控。接着，向聚四氟乙烯（P-T-F-E）载玻片的每个孔中加入5微升已冷却至37摄氏度的含1%低熔点琼脂糖的TBE缓冲液，随后将载玻片装入流式细胞仪，以捕获分选后的病毒颗粒。

开始分选，在部分孔中捕获10个或更多病毒颗粒事件，以帮助在共聚焦激光扫描显微镜下检测病毒的深度。分选完成后，将载玻片从流式细胞仪中取出，并向每孔中加入5微升已冷却至37摄氏度的低熔点琼脂糖，以包埋病毒颗粒。对于单个病毒颗粒，将共聚焦激光扫描显微镜设置为488纳米激发波长。然后使用63倍长工作距离物镜对包埋的颗粒进行成像，以确认仅存在单个颗粒且多个病毒颗粒未重叠堆积。在确定含有单个病毒颗粒的孔后，使用刀片将目标琼脂糖珠从载玻片上切下，并放入无菌PCR管中。

将离心管置于设定为 94 摄氏度的 PCR 仪热块中，加热 3 分钟，以原位裂解病毒颗粒。随后进行改良的 MDA 反应，将扩增的基因组 DNA 转移至 1.7 毫升的 Eppendorf 管中，并加入 1/10 体积的 3 摩尔醋酸钠（溶于 TBE 缓冲液），以纯化扩增的基因组物质。将样品置于 55 摄氏度下 10 分钟，以溶解琼脂糖，然后将离心管转移至 42 摄氏度，降低温度后再加入酶。现在向每管中加入 2 单位的 β-琼脂糖酶，并孵育 2 小时。

然后向每支试管中加入等体积的缓冲饱和酚溶液。充分混匀后，在室温下以3,500 × g离心15分钟。将含有DNA的上清液转移至新的1.7毫升Eppendorf管中。接着，向每管中加入等体积的100%异丙醇和1微升甘油蓝（glyco-blue），倒置混匀。再次离心，此次在4°C、28,000 × g条件下离心60分钟，小心倾去异丙醇，避免扰动沉淀，并向每管中加入150微升70%乙醇。在室温下以28,000 × g离心10分钟，弃去乙醇，将DNA沉淀空气干燥，然后用适量体积的Tris-EDTA缓冲液重悬DNA。该三维重建图像显示了琼脂糖微珠内经SYBR Green I染色的单个病毒颗粒，展示了共聚焦激光扫描显微镜如何用于可视化并确认在捕获后嵌入琼脂糖的每个微孔中均获得了单个病毒粒子，插图为分离的病毒颗粒的高倍放大图像。

此处显示了琼脂糖微珠内染色的单个病毒颗粒的相对荧光强度轮廓图。本组最后一系列图示表明，对于该代表性病毒，除前五个碱基对外，几乎整个λ基因组均被成功回收。此处展示了所鉴定的单个病毒基因组的GC含量图。该图显示了λ噬菌体的基因组图谱。最后，展示了代表性分离并扩增的λ噬菌体单个病毒基因组的比对结果。X轴表示基因组位置，Y轴表示覆盖百分比。

在进行该实验操作时，重要的是采用无菌技术，并花费足够时间确保避免污染。完成此操作后，可采用其他方法在全基因组测序前评估所分离病毒颗粒的分类学特征。观看本视频后，您应能够清楚掌握如何利用荧光激活细胞分选、共聚焦显微镜和全基因组扩增技术来分离单个病毒颗粒。