控制超分子聚合物在水中的尺寸、形状与稳定性

以下实验的总体目标是在水中控制超分子动态纳米颗粒的尺寸、形状和稳定性。通过设计可自组装或聚合的双亲性扩增分子，并使其分子结构具备吸引和排斥相互作用，从而实现这一目标。该策略导致一种受阻生长机制，可在水中形成具有可控球形结构的自组装纳米颗粒。

第二步是提高水溶液的盐浓度，这会削弱碟状两亲分子结构中所编码的排斥相互作用。这一变化诱导了从球形到棒状结构的转变。通过温度依赖的圆二色性（CD）光谱分析来研究该球-棒转变的内在机制。此外，结合使用冷冻透射电子显微镜和核磁共振等多种分析技术，对一种聚集体向另一种聚集体的转变过程进行测量和可视化观察。实验结果表明，球-棒转变表现为超分子聚合过程中协同性的显著增强。

这种现象源于受限尺寸纳米颗粒中反协同过程向完全协同的成核-延伸机制的转变，在本例中导致形成非常大的超分子聚合物，即动态纳米棒。将圆二色光谱、小角X射线散射和核磁共振等光谱技术与冷冻电镜等显微技术相结合的主要优势在于，能够对水中超分子聚合物的转变过程进行测量和可视化观察。这些动态聚合物可对外部刺激作出响应，例如温度变化、离子强度变化或pH值变化。

这些方法的结合具有广泛的适用性，有助于回答分子化学和自组装纳米材料领域的关键问题。例如，可以研究小分子构筑单元通过自组装形成的聚集体尺寸与其内在形成机制之间的关联。该方法学的意义可延伸至广泛的生物纳米技术应用领域。

我们对生物医学成像领域特别感兴趣，尤其是自组装纳米颗粒对比剂的开发。在临床应用中，这类自组装对比剂的成功关键在于其聚集体稳定性、高对比度以及可被机体排泄的能力之间需达到精妙的平衡。当意识到自组装基本单元的分子结构发生细微变化即可导致超分子聚合机制的根本性差异时，我们首次提出了结合多种表征技术的研究思路。本次实验操作将由保罗·博蒙特（Paul Beaumont）演示，他是特罗旺技术大学冷冻电镜设施的专家及负责人。

按照书面实验方案所述，首先在 100 毫摩尔柠檬酸盐缓冲液中配制 A BTA 钆 DTPA 溶液。随本视频操作，将该溶液注入一个 1 厘米的紫外石英比色皿中。然后将比色皿插入圆形 D crowism 分光光度计的比色皿支架内。

在230至350纳米范围内测量圆二色光谱。然后，在363至283开尔文范围内，以每分钟1开尔文的速率，在圆二色信号最强的波长处测量变温圆二色谱。接下来，向BTA钆-DTPA的柠檬酸缓冲溶液中加入等体积的2摩尔氯化钠缓冲溶液。

这将使离子强度增加至一摩尔氯化钠，并使discos的浓度稀释至原来的一半。离子强度提高后，将溶液涡旋振荡40秒，随后重新测量230至350纳米范围内的圆二色光谱。然后，在最强的圆二色吸收峰处，以每分钟1开尔文的速率，测量从363至283开尔文的圆二色冷却曲线。

将原始CD数据导出至Origin 8.5。通过定义最高测量温度下的CD效应为零，最低测量温度下的CD效应为一，对光谱进行归一化处理，因为CD效应的大小与聚集程度成正比，因此归一化后的CD曲线反映了聚集程度的变化。使用Origin Pro 8.5中的非线性曲线拟合功能，结合温度依赖性自组装模型对归一化数据进行拟合。

在此模型中，区分了成核阶段和延伸阶段。首先，拟合延伸阶段的聚集程度。在此方程中，T 代表可变温度。

PHI N 是净手性，与聚集程度成正比，HE 是分子的延伸焓。T TE 表示延伸温度，即自组装开始在热力学上变得有利的温度。引入归一化因子 fiat 以确保 Phi N 除以 fiat 的值不超过 1，这是因为聚集程度受到不能超过某一上限的约束。

通过Unity拟合，可以提取出每摩尔焦耳为单位的延伸焓以及以开尔文为单位的延伸温度，从而表征在给定浓度下分子的自组装行为。在进行拟合时需遵循约束条件：仅对低于TE温度下的聚集度进行拟合，因为该方程仅在首次拟合后的延伸阶段有效。完成第一方程拟合后，成核阶段方程中唯一的未知参数是活化常数ka，该常数用于描述超分子聚合的协同性。为确定活化常数的拟合值，需采用实验测得的在成核阶段高于TE温度时的聚集度数据进行拟合。

首先按照文中所述准备透射电子显微镜所需的溶液。简而言之，配制两种缓冲液：100 毫摩尔/升的柠檬酸盐缓冲液，以及含 5 摩尔/升氯化钠的 100 毫摩尔/升柠檬酸盐缓冲液。将 BTA 钆喷酸（Gd-DTPA）分别溶于 0.1 毫升上述两种缓冲液中，使其终浓度达到 1 毫摩尔/升。随后，使用 C Resington 2 0 8 碳镀膜仪（工作电流为 5 毫安）对 Quantifoil 碳膜载网进行 40 秒的等离子体处理。

玻璃化冷冻是冷冻电镜技术中的关键步骤，因为它可确保形成一层适合进行透射电子显微镜（TAM）分析的光滑ISIS薄层。在自动化的FEI Vitrobot上进行玻璃化冷冻时，将水溶液样品施加于载网之上。该过程包括将样品滴加到载网上，吸除多余液体以在载网上形成一层薄薄的水溶液膜，随后将载网迅速浸入液态乙烷中实现快速玻璃化冷冻。

玻璃化处理后立即将载网转移至液氮中以保存，随后手动将样品载网转移至同样用液氮冷却的自动进样盒中。下一步是将该进样盒插入TUE Cryo Titan透射电子显微镜的自动进样系统。TUE Cryo Titan配备有在300千伏下运行的场发射电子枪。

采集TAM图像需要经验并快速操作，因为高能电子束在成像过程中会对样品造成损伤。使用配备有后列能量过滤器的CCD相机记录图像。由于钆具有强顺磁性，会导致质子信号显著展宽，因此采用了一种不同的磁盘，其中将钆替换为抗磁性的钇，并使用了BT钇溶液。

制备DTPA。计算需要多少毫克的BT atrium DTPA（分子量为2,979克/摩尔）才能达到1毫摩尔的目标浓度。随后，将确定量的BT atrium DTPA溶解于50毫摩尔的去离子琥珀酸盐缓冲液（D2O）中，然后用移液器将0.6毫升所得溶液转移至Wilm的LABAs NMR管中。

将样品插入配备Varian五毫米I-D-P-F-G探头的Nova 500波谱仪中的变体单元。在记录标准质子NMR谱后，根据测得的90度脉冲并相应优化混合时间，按照文中所述进行DOI实验。在测定卵巢参考探针中HDO的自扩散后，采用DOI单次脉冲序列，并在样品中根据聚集体的扩散系数计算其流体动力学半径。

最后，利用球形粒子扩散的斯托克斯-爱因斯坦关系式计算聚集体的流体动力学半径 RH。外围钆DTPA配合物的离子特性对碟状单体的一维生长引入了阻碍作用，而这些单体的核设计为可聚合形成棒状延伸的聚集体。吸引与排斥相互作用之间的平衡控制着聚集体的大小和形状。

一种用于确定颗粒和溶液尺寸与形状的有力技术是同步辐射源。小角X射线散射（SAXS）或SUCKS。将Gd-DTPA溶解于柠檬酸盐缓冲溶液中，并在两种不同浓度下记录SUCKS谱图。

低Q区域斜率接近零表明聚集体无特定形状且具有各向同性，提示存在球形结构。在不同浓度下测得的数据通过均一单分散球形形态因子进行拟合，计算得到的半径为3.2纳米。单体disco-BTA-钆-DTPA的计算几何半径为3.0纳米，该结果进一步支持自组装结构为接近球形且具有纳米尺度，其长径比接近1。

进行了质子扩散有序核磁共振波谱分析。扩散有序核磁共振（DOI NMR）可用于测定超分子聚集体的扩散系数，进而计算其流体动力学半径。通过斯托克斯-爱因斯坦关系式，测得在氘代琥珀酸盐缓冲液中聚集的抗磁性二向色性放大物的扩散系数为 0.69 × 10⁻¹⁰ m²/s。

对于球形的离散物体，计算得到其流体动力学半径为2.9纳米。该尺寸与通过SOX数据获得的BTA钆喷酸（gadolinium DTPA）数值高度一致。此外，冷冻透射电子显微镜（cryo TEM）显微图像提供了成功调控一维堆叠长度的进一步证据。

钆喷酸（Gd-DTPA）在1毫摩尔浓度下生成了预期的球形结构，其直径接近6纳米，这证实了小角X射线散射（So）和DOI测量的结果。在高离子强度条件下，冷冻透射电镜图像中明显观察到高长径比的棒状超分子聚合物的形成。静电屏蔽很可能是这一现象的主要原因。

其形状从直径约六纳米的球形聚集体转变为直径为六纳米、长度可达数百纳米的棒状结构。此处展示了随着盐浓度增加，BTA 钆喷酸（BTA Gadolinium DTPA）在室温下的圆二色光谱。在低离子强度下，BTA 钆喷酸的浓度为 8 × 10⁻³ 毫摩尔，在高离子强度下为 4 × 10⁻³ 毫摩尔。

尽管圆二色性（CD）测量所用的浓度显著降低，但明显的棉酚效应表明，即使在微摩尔浓度下，完整的聚集体仍然存在。随着盐浓度的增加，CD谱图的形状发生变化，这很好地说明了堆积体外围的排斥作用减弱，十聚体的堆积更加紧密。此外，相同溶液的CD冷却曲线在形状上也表现出明显差异。

聚集开始的温度随盐浓度升高而向更高温度偏移。随着盐浓度增加，聚集过程表现出越来越强的协同性，其特征是圆二色（CD）效应急剧增强；而在零摩尔氯化钠条件下，冷却曲线最符合等温自发自组装模型，表明该过程具有抗协同性。在1.0摩尔氯化钠条件下的冷却曲线则呈现出典型的协同性自组装特征，可用成核-延伸模型进行描述，从而量化BTA钆-DTPA在零和一摩尔氯化钠条件下的自组装热力学参数。

采用协同模型可以清晰地揭示无量纲活化常数 ka 的降低。KA 值越低，表明自组装过程中的协同性程度越高，这体现在高度伸长的超分子聚合物的形成上。正如在冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）中所观察到的，在尝试演示这些实验技术时，必须牢记只有结合多种实验方法，才能对所研究的动态纳米材料获得有意义的整体描述。

观看本视频后，您应能充分理解我们这种联合实验方法的广泛应用性，以及它如何有助于回答自组装纳米材料和超分子体系领域中的关键科学问题。