肝微循环中血流与氧耗的可视化与分析：在急性肝炎模型中的应用

开发了一种光学系统，用于通过荧光标记的红细胞观察肝脏微循环，并利用激光辅助磷光成像技术测量微血管中的氧分压。该方法可通过分析微血管结构、管径、血流速度和氧张力，研究生理和病理机制。在肝脏微循环中，血液从门静脉小静脉流向中央静脉，从而在两者之间形成氧梯度。

肝脏中的氧浓度会影响酶的表达和病理变化，因此血流分析和氧浓度测量成为重要的研究课题。我们的实验方法包括静脉注射用荧光标记的红细胞。

为了利用荧光可视化微循环并测量氧分压，我们通过静脉注射原卟啉钯，该物质在激光激发下会发出磷光，其发光强度取决于周围氧气的浓度。该方法可对氧进行定量分析，通过测量肝微循环的氧分压，分别显示门静脉和中央静脉的氧分压为59.8和38.9毫米汞柱，证明了氧浓度的有效测量。接下来，我们将该方法应用于肝炎模型。

我们发现门静脉区ES窦状隙和中央静脉区的氧分压升高，但门静脉区与中央静脉区之间的压力差减小。这可能是由于肝细胞坏死导致中央静脉区的氧消耗减少所致。这些结果表明，我们采用光学系统测量肝脏血流动力学和氧消耗的方法能够阐明肝微循环中多种肝病的发病机制。

氧梯度是影响肝门管区和中央静脉区酶表达以及与微分布相关的各类肝病的重要参数，因此定量血流和氧消耗至关重要。为了阐明其机制，本方法的优势在于采用非接触、连续的光学测量，可定量肝微循环中的血流、微血管直径和氧梯度。全血取自供体小鼠，红细胞经PBS洗涤两次，每次以400 G离心5分钟。

接下来，将2毫克FITC溶解于1毫升100毫摩尔的去离子磷酸氢二钠溶液中，然后通过0.2微米孔径的膜过滤。随后，取1毫升FITC溶液置于试管中，加入0.15毫升3毫摩尔的葡聚糖溶液、0.25毫升180毫摩尔的去离子磷酸氢二钠溶液以及1.5毫升100毫摩尔的去离子磷酸氢二钠溶液，轻轻振荡混匀。室温避光孵育2小时，然后用PBS洗涤染色后的红细胞两次。

接下来，取少量红细胞悬液置于玻片上，观察红细胞形态是否正常，并确认具有足够的荧光。将0.1毫升红细胞悬液加入0.9毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，混匀后于4摄氏度保存备用。随后，将500毫克牛血清白蛋白（BSA）溶解于10毫升PBS中。加入30毫克钯卟啉，室温下搅拌过夜。离心溶液以去除未溶解的钯卟啉，并将上清液通过0.2微米孔径滤膜过滤。取1毫升滤液分装至试管中，于-20摄氏度保存。注意避免反复冻融。

为了在显微镜下观察微循环，可在一块塑料板上切割出一个直径为20毫米的孔，并用一块边长为30毫米的方形盖玻片覆盖该孔。在尾静脉插管后，将肝脏主要叶以俯卧位平铺于塑料板上。接着，使用多个尺寸为3毫米×8毫米的塑料保鲜膜条覆盖在肝叶周围的区域，以防止呼吸运动和干燥导致的组织移动。

使用透射显微镜观察肝内血液循环，并确认在至少15分钟内视野中无血流停滞现象。为观察血流情况，逐步注入0.2毫升荧光标记的红细胞。

为测量氧分压，需注入0.2毫升的钯卟啉溶液。FITC标记的红细胞将占可视化区域中循环红细胞总数的五十分之一。使用通过450至490纳米带通滤光片的汞灯照射以激发FITC，并用CCD相机记录荧光信号。钯卟啉的磷光相对较弱，需要高灵敏度检测器并在暗室中进行操作。

钯卟啉的吸收峰位于约410纳米和532纳米处，推荐使用532纳米的二次谐波波长。该波长由掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）脉冲激光器产生，将激光束连接至倒置显微镜，并调节使光束照射到焦平面中心。激光的空间分辨率取决于光斑尺寸，可通过使光束穿过针孔来调节光斑大小。

将长通滤光片和光电倍增管连接至显微镜，用于检测磷光信号。光电倍增管应对红光波长敏感，尤其在约700纳米附近。采集磷光信号，并通过拟合指数函数计算其衰减时间常数。

在本实验中，我们在 200 千赫兹下采集了 500 个数据点。为进行校准，准备两份氧分压分别为 150 和 0 毫米汞柱的钯卟啉溶液。对于 0 毫米汞柱的溶液，向样品中加入 1% 二硫代硫酸钠，以在校准期间创造无氧条件。

维持样品 pH 为 7.4，温度为 37 摄氏度。将小鼠置于显微镜载物台上，调整微血管位置，使激光光斑对准需观察肝脏微循环的区域。小鼠自由饮水过夜后，以每公斤体重 200 毫克的剂量腹腔注射对乙酰氨基酚。注射后 24 小时，麻醉小鼠并经腹正中切口暴露肝脏。若存在肝炎，可通过中央旁区的坏死灶在肉眼水平清晰观察到。

我们对小鼠肝组织中部分氧分压和微血管的测量结果显示，门脉区、窦周区和中央静脉区的平均氧分压分别为 59.8、48.2 和 38.9 毫米汞柱。换句话说，从门脉区到中央静脉区的氧梯度表明红细胞在流经肝窦时能够充分释放氧气。我们建立了对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝炎模型，用于测量肝微血管的变化。

作为一个病理学模型示例，我们发现对乙酰氨基酚组小鼠门静脉、窦状隙和中央静脉中的氧分压高于正常小鼠。正常小鼠门静脉与中央静脉之间的氧分压差为20.9毫米汞柱，而肝炎模型小鼠为16.9毫米汞柱。正常小鼠门静脉与中央静脉之间的氧分压差为20.9毫米汞柱，而肝炎模型小鼠为16.9毫米汞柱。

肝微循环中的氧梯度主要源于门静脉提供的氧气被肝细胞消耗，对乙酰氨基酚引起的中央静脉区肝细胞坏死导致氧消耗减少，进而影响下游微循环，从而引发与血流动力学相关的问题。氧供应与氧消耗参与多种肝脏疾病的发生发展。我们建立了急性肝炎模型，发现微血管中氧张力升高。

我们的光学系统可通过分析微血管结构、血流分布及氧消耗情况，用于研究生理和病理机制。