单卵母细胞亚硫酸氢盐突变分析

本实验的总体目标是对单个卵母细胞中的DNA甲基化进行分析。首先，从采集的卵母细胞中去除卵丘细胞和颗粒细胞；第二步是将卵母细胞包埋于2:1的裂解液中，以保护微量DNA不丢失或降解。

接下来进行亚硫酸氢盐介导的诱变，随后通过巢式聚合酶链式反应进行扩增。最后一步是将PCR产物进行连接并克隆。随后挑取克隆，进行PCR扩增并送测序。

最终，通过亚硫酸氢盐诱变与测序技术，可检测单个卵母细胞中特定区域胞嘧啶磷酸鸟嘌呤（CPG）二核苷酸的DNA甲基化状态。与传统的亚硫酸氢盐诱变方法（如基于大量细胞）相比，该技术的主要优势在于能够从单个卵母细胞中获取数据，避免了细胞混合、PCR偏差以及体细胞污染带来的干扰。在卵母细胞采集当天，应根据书面实验方案新鲜配制所列溶液；配制过程中，为减少DNA污染风险，需频繁更换手套、使用带滤芯的吸头，并在打开离心管时保持管口倾斜朝向一侧，不使用时应及时盖上管盖。

将解剖后的小鼠输卵管放入 M2 培养基中，撕破 M 滑轮以释放卵丘细胞复合体，开始 OSI 样本收集。随后，在 30 微升 M2 培养基液滴中，使用含 0.3 毫克/毫升透明质酸酶的溶液将卵母细胞从卵丘细胞复合体中分离。仅在去除卵丘细胞所需的时间内使卵母细胞保持在溶液中，长时间暴露可能对其造成损伤。

将卵母细胞在30微升M2培养基液滴中依次转移，进行洗涤。定期去除卵丘细胞，共洗涤三次。使用酸性泰罗德溶液去除ZP层。

首先将卵母细胞置于一滴30微升的溶液中，然后转移至另一滴30微升的溶液中。因为携带的任何培养基都会稀释酸液，降低其作用效率。仅需将卵母细胞在溶液中停留至去除透明带所需的时间即可，长时间暴露可能会对其造成损伤。

去除透明带后，将卵细胞再次在30微升M2培养基液滴中洗涤，以进行琼脂糖包埋。首先将裂解液置于70摄氏度的加热块上。向裂解液中加入预热的低熔点琼脂糖（LMP Agarose），制成琼脂糖与裂解液比例为2:1的混合液。然后将单个卵母细胞置于洁净的玻璃载片上，加入极少量M2培养基。

下一步是将单个细胞迅速嵌入琼脂糖裂解液中。此步骤必须快速完成，因为琼脂糖在低于65摄氏度的温度下会凝固。在显微镜下，用移液器吸头吸取10微升琼脂糖裂解液。

轻轻将约一微升或更少的裂解液排出到载玻片上，使其与最小培养基混合。轻柔地用移液枪头吸取卵母细胞。然后将全部10微升液体转移至含有300微升矿物油的离心管中，使形成的液滴呈球形。

将离心管置于冰上孵育10分钟以进行裂解。移除300微升矿物油，加入500微升SDS裂解缓冲液。在第二天将样品置于50摄氏度的水浴中孵育过夜。

按照书面方案所述，新鲜配制硫化物诱变溶液。开始诱变前，彻底移除 500 µL 的 SDS 裂解缓冲液。需注意，残留的任何裂解缓冲液在加热时会稀释农杆菌，且在后续步骤中磁珠更易发生溶解。

完全去除裂解缓冲液后，加入 300 微升矿物油。将样品置于 90 摄氏度的加热块上孵育 2.5 分钟。注意避免混合、搅拌、温度延长或波动。

两分半钟后，将样品在冰上孵育10分钟。进行变性操作时，移除石蜡油，向试管中加入1毫升0.1摩尔的氢氧化钠，轻轻弹击并倒置试管5至6次。

将样品孵育15分钟。在37摄氏度的水浴中，每3至4分钟颠倒一次，珠子应在氢氧化钠溶液中悬浮。注意珠子不再位于管底。

进行亚硫酸盐处理时，首先在去除氢氧化钠后轻轻离心试管。加入300 µL矿物油和500 µL BIS亚硫酸盐溶液。注意避免光照，并将试管置于50 °C水浴中孵育3.5小时。

现在进行脱磺酸化处理。首先将样品在冰上孵育三分钟，然后去除矿物油和BIS亚硫酸盐溶液。轻轻离心后，加入一毫升0.3摩尔氢氧化钠溶液，快速振荡并倒置离心管五到六次。

将样品在37摄氏度水浴中孵育15分钟，每三到四分钟颠倒一次。再次确认磁珠在开始PCR前应悬浮于氢氧化钠溶液中。首先轻轻离心，洗涤样品。

然后去除氢氧化钠，加入1毫升1 ×TE（pH 7.5）。在室温下振荡5到10分钟。再次轻柔离心后，去除1 ×TE。

重复此洗涤过程两次。然后加入一毫升经高压灭菌的双蒸水。在室温下振荡五到十分钟，再次轻轻离心，去除上清液。

用双蒸水重复清洗两次。最后，移除所有上清液，仅保留琼脂糖珠。检查上清液的 pH 值是否为 5.0。

如果上清液仍然过于偏碱性，则用双蒸水再次洗涤磁珠。同时，按照书面实验方案中的描述，将第一轮 PCR 混合液加入 PCR 管中。将固相农杆菌快速移至 einor 管的管口处。

然后小心地将农杆菌速转至PCR管中，在70摄氏度下加热一分钟并混匀，随后按照书面实验方案进行扩增。第一轮扩增结束后，取5 µL第一轮扩增产物作为模板，制备第二轮PCR反应。务必在矿物油层下方加样。

按照文中指示进行第二轮扩增，作为诊断检测。第二轮扩增产物可用甲基化特异性或菌株特异性的限制性内切酶进行酶切，并将酶切产物在8%丙烯酰胺凝胶上进行电泳。若出现任何异质性条带，则表明存在不止一种序列；将第二轮扩增产物连接至载体中进行TA克隆，具体操作参照本视频配套论文所述。完成TA克隆后，将全部反应混合物涂布于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB琼脂平板上，于37°C培养过夜。

然后按照书面方案中列出的成分，将菌落PCR预混液加入PCR管中。用移液枪枪头从平板上挑取一个白色细菌菌落，并将其在PCR管中与35 µL菌落PCR预混液充分混匀。随后按照文本描述进行扩增反应，PCR扩增完成后，取4 µL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

最后，将每个细胞的五个菌落PCR产物中的约30微升送测序。获得测序结果后，可读取甲基化模式：任何仍保持为胞嘧啶-鸟嘌呤（cytosine guanine）的位点均为甲基化；相反，任何现已变为胸腺嘧啶-鸟嘌呤（thiamine guanine）的原始胞嘧啶-鸟嘌呤位点，则在使用亚硫酸氢盐转化引物进行巢式PCR扩增后为非甲基化状态。

可以通过在染色体展片的单个中期相上观察到正确大小的片段来确认转化成功。两个卵母细胞代表一个亲本等位基因，理论上具有一个印记甲基化模式。因此，可以对第二轮PCR产物进行检测，以排除意外污染。

可使用对DNA甲基化敏感的限制性内切酶消化第二轮PCR产物，以评估其是否含有甲基化或非甲基化等位基因。此处，酶识别序列内的甲基化胞嘧啶会被切割；而经转化变为胸腺嘧啶的非甲基化胞嘧啶则不再被该酶识别，因而保持未切割状态。任何含有甲基化与非甲基化等位基因的中期II卵母细胞样本均应弃用，因其提示存在卵丘细胞污染或极体混入，此情况发生于连接与转化之后。

可通过 AROS 凝胶观察成功的菌落 PCR 扩增结果，以确保将具有正确产物大小的样本送测序。在此示例中，连接后的预期扩增片段大小为 156 个碱基对。此处，克隆 5 的扩增片段大小不正确，不应送测序。

来自一个减数分裂二期卵母细胞的五个单克隆序列应产生五个完全相同的甲基化模式以及相同的非CpG转化率。任何包含多于一种模式的样本均应被弃用。由于排卵后的减数分裂二期卵细胞具有两份染色体拷贝或附连的极体，有可能获得两种相似的序列模式。

应舍弃那些甲基化模式存在高度差异的细胞的数据。由于在进行该操作时无法完全排除卵丘细胞污染的可能性，因此需注意：首先，在HI IDE处理后，必须将卵母细胞在新鲜培养基中反复清洗多次，以尽可能去除卵丘细胞；其次，低熔点琼脂糖在低于65摄氏度的温度下会凝固，因此操作时需谨慎但迅速。

最后，亚硫酸氢钠和氢醌对光敏感，因此反应管和溶液应包裹铝箔。