小动物中用于癌症生物标志物定位的计算机断层扫描引导时域漫射荧光断层成像

以下实验的总体目标是在原位胶质瘤小鼠模型中生成表皮生长因子受体表达的荧光图像。该目标通过将表达绿色荧光蛋白的人源U251胶质瘤细胞接种至A IIC小鼠的左侧大脑半球来实现。在肿瘤生长两周后，向小鼠注射两种荧光示踪剂的混合物。

随后将小鼠置于小动物X射线系统中成像，以采集准确图像重建所需的解剖学数据。这些数据用于在解剖学上定位光学断层成像系统的光源并确定探测器的位置，同时使用定制软件采集荧光数据并构建最终图像。最终，该方法可结合荧光成像与X射线成像，基于肿瘤对表皮生长因子的过表达来构建肿瘤图像，其准确性可与对比增强磁共振成像进行比较。

与现有的电荷耦合器件式小动物荧光断层成像等方法相比，该技术的主要优势在于，采用光电倍增管进行单光子计数检测，可显著提高光检测的灵敏度和动态范围。该方法最终可用于通过检测分子靶标的表达情况，监测并评估分子治疗的效果。虽然皮下肿瘤可通过非断层成像的表面成像方法轻松实现成像，但本系统能够对数厘米厚的组织进行穿透成像，因此特别适用于脑肿瘤中成像对比、示踪剂递送及渗漏情况的观察。

尽管该方法可为癌症生物标志物的表达提供见解，但也适用于其他疾病研究，如感染、肥胖或阿尔茨海默病等衰老相关因素。通常，初学者会因光在生物组织中传播的散射特性以及在漫射光重建中使用X射线断层扫描的困难而遇到挑战。因此，对该方法的可视化演示至关重要。

由于数据采集和图像重建步骤较难掌握，确保从荧光系统收集的数据经过良好校准非常重要。近红外快速软件包旨在读取光学数据，并利用X射线断层扫描图像生成有限元网格，该网格作为荧光重建的空间模板。开始时，将一只麻醉的裸鼠置于无菌手术单上，在继续操作前确认麻醉深度，并清洁和消毒切口区域的皮肤。

使用聚维酮碘对切口部位进行消毒，然后铺上无菌手术巾。使用手术刀在中线略偏左侧、眶间线后方0.5厘米处做一个小切口。清除颅骨表面的结缔组织，以暴露颅骨表面，便于识别解剖标志。颅骨暴露后，使用无菌的1毫米钻头在高速钻机上操作，在中线左侧2毫米、bgma后方2毫米处钻出一个孔。

使用带有平头27号针头的Hamilton Micros注射器吸取待移植的细胞。然后将小鼠固定于立体定位仪上。接着通过脚趾夹捏试验确认小鼠已达到充分的外科麻醉深度，并为动物重新铺好手术巾。

接下来，将装好样品的注射器固定在立体定位仪上。将注射器置于颅骨孔洞上方，将针尖插入颅骨表面以下3毫米处。随后，将针头回撤1毫米，以形成一个空腔。

下一步是在五分钟内缓慢地将细胞注入左侧大脑半球。注射完成后，拔出针头，并用碘伏擦拭穿刺孔。为防止细胞在注射部位以外生长，将小鼠从立体定位架上取出，并用预热的骨蜡填充暴露的孔洞。

最后，用无菌5-0尼龙缝线缝合切口部位。将小鼠放回加热的笼子中，并监测至其完全恢复；恢复后，通过腹腔注射给予小鼠130微升浓度为0.1毫克/千克的丁丙诺啡，并在成像前让肿瘤生长14天。在小鼠成像当天，启动系统，使激光器和光探测器预热约20分钟。

为避免漂移和系统灵敏度变化，在成像机架正中心放置一个100度乘以4度的工程线性扩散器，以使激发激光在系统的各个检测通道中均匀分散。手动调节扩散器的角度，以最大化所有五个光收集通道检测到的信号量。接下来放置光学密度。

在所有用于荧光检测的光电倍增管（PMT）前方放置两个中性密度滤光片，以及用于透射光检测的光电倍增管前方放置一个中性密度滤光片。每个激光器依次工作，PMT 对激光信号采集 100 个时间脉冲展宽函数（TPSF），每次积分时间为 1 秒。对每个 TPSF，依据激光参考信号进行归一化处理，以校正激光参考信号的时间漂移，并对每个探测器和每个激光器分别进行多次迭代后的结果取平均。

这些平均TPS是光学图像重建中所用的探测器特异性仪器响应函数，需在成像操作前12小时确定。向测试小鼠注射荧光示踪剂混合物。荧光断层成像系统的精确校准以及限制动物运动是该操作中最困难的两个方面。

成像重建过程具有高度的病态性，即使数据采集过程中存在微小误差，也可能导致重建图像出现显著偏差。为确保采集数据的准确性，我们尽可能固定小鼠，并在扫描前后重复校准，以提高获得准确校准结果的可能性。准备就绪后，将麻醉后的动物放置于成像床的玻璃纤维支撑物上。

将动物头部置于鼻罩内以进行持续气体麻醉后，固定其门齿于咬合杆上，并用胶带固定动物。小鼠应大致位于成像设备的中心位置。可通过将激发激光围绕小鼠旋转180度来辅助定位，确保从激光各个角度观察时，激光焦点始终照射在小鼠大致中央的位置。

正确放置后，小心地将成像床及小鼠转移至微型 CT 扫描仪，以 93 微米各向同性分辨率采集小鼠整个头部的解剖学信息。可视化 CT 图像序列，并选择需用荧光断层成像系统进行成像的切片。随后小心地将成像床和小鼠重新转移回荧光断层成像系统。

选择每个成像切片的光源位置数量、每次TPSF测量的积分时间、每个光源位置的迭代次数，以及从先前创建的CT图像堆栈中确定所需成像切片的位置和数量。接下来，在荧光检测PMT前放置滤光片，以阻隔所有激发光，并在透射检测PMT前放置中性密度滤光片。为避免这些探测器饱和，运行数据采集软件，在两个激发波长下，于每个定义的光源-探测器位置采集荧光和透射tPSF数据。

对于每组采集的 T psfs，使用参考 PMT 通道监测并记录激光强度。确定小鼠的外表面以及成像床的位置。根据 CT 图像中的支撑杆创建掩膜，覆盖小鼠和成像杆的范围。

另外，使用小鼠掩模，通过近快速软件生成动物的有限元网格。根据微型CT和荧光空间配准坐标，将荧光断层成像系统的光源和探测器位置定位在网格表面。剔除与成像床位置相互作用的光源或探测器位置相关的光学数据点。

支撑杆通过激光参考值对每个源-探测器位置采集的数据进行归一化，校正激光参考值的时间漂移，并校正由购买时实验测试确定的滤光片灵敏度。计算每个源-探测器位置数据的玻恩比值，并将其乘以基于有限元动物网格在均匀光学特性下的透射率正向模型模拟结果。此步骤旨在减小与光源或探测器与组织耦合相关的误差，将数据校准至模型，并调整模型与数据之间的其他不匹配因素，从而构建一个由两个波长下采集的玻恩比值数据经缩放后的差值组成的数据向量。

选择缩放因子以最大化 EGFR 结合对比度，利用每个检测通道的 TPSF 作为输入，基于校准后的差异数据进行时域图像重建，并生成所观察到的对比度增强靶向示踪剂的荧光分布图。以下是一个荧光重建图像的示例，该图像与一只携带 U251 原位胶质瘤的小鼠的共配准 CT 解剖图像重叠显示。通过荧光重建确定的胶质瘤质心与通过对比增强磁共振成像确定的肿瘤质心位置相差在 1 毫米以内。

该设备的数据采集软件为定制开发，但大多数图像处理技术可使用 nearfasts.org 网站提供的近快速软件完成。因此，在执行此操作时，必须确保在图像重建之前，系统和数据均已准确校准。该校准需要考虑探测器之间的灵敏度和时间差异。在完成针对生物标志物的示踪剂图像重建后，需进行上述校准步骤。

对非靶向示踪剂进行类似的成像可校正非受体介导的摄取，从而在方法建立后实现对示踪剂结合量以及体内受体密度的定量分析。该技术的出现启发了其他研究人员设计出X射线成像引导的荧光断层成像系统，并为大型动物的全身成像铺平了道路。

观看本视频后，您应能充分理解如何开展漫反射荧光断层成像实验，该实验结合了X射线解剖成像与光学成像系统，用于癌症生物标志物的成像研究。