通过联合方法在单细胞分辨率下实现小鼠肺转移灶的优化可视化 原位 肺组织灌注与X-Gal染色 lacZ-标记的肿瘤细胞

本实验的总体目标是在保持小鼠肺组织膨胀结构的前提下，提高体外检测肺部微转移灶的能力。首先通过原位灌注 PBS 以清除血液，从而去除该组织中主要的背景色来源。接下来的步骤是通过注射 PFA 使肺组织膨胀，随后夹闭气管，使肺组织在膨胀状态下固定。

接下来，取出肺组织，进一步用PFA固定，或对单个肺叶进行包埋以进行冷冻切片。最后步骤是用Xal溶液对组织进行染色，并在双目显微镜或光学显微镜下观察LA zag肿瘤细胞，从而可在整个肺叶或肺组织切片中检测到单个细胞水平的转移灶。与现有方法（如sky染色法）相比，该技术的主要优势在于，通过去除与血液相关的背景干扰，显著提高了微转移灶的可检测性。

首先，通过腹腔注射约150微升PBS溶液中的氯胺酮、赛拉嗪和乙酰丙嗪对小鼠进行麻醉。当观察不到小鼠的疼痛反射时，将其固定在手术台上。随后，使用70%乙醇向后梳理并清洁毛发。

从腹部向上切开皮肤至颈部。将皮肤向两侧拉开或去除。小心切开胸腔内的腹膜，以防止颈静脉等大血管破裂。

这将提高灌注效率。现在使用带有21至24号针头的20毫升注射器，在肝脏下方剪断下腔静脉。缓慢向跳动心脏的右心室注入10至15毫升PBS，直至肺部完全变白且心脏停止跳动。

然后用血管夹夹闭肝脏和膈肌上方的血管。用10毫升注射器吸取3%多聚甲醛，使用21至24号针头注入右心室，约2毫升。

在胸腔外暴露气管，并从胸腔外向气管内注射约三毫升醛类固定液以充盈肺部。拔出针头后立即用血管夹夹闭穿刺部位附近的气管，静置10分钟以完成固定。随后，在血管夹上方切断血管。

然后移除夹钳，并向右心室注入约 2 毫升 PBS，以清除过量的多聚甲醛。用针头刺破所有肺叶的下部，并解除气管处的血管夹。现在向气管注入 3 至 5 毫升稀释的包埋液，注射方式与前一次注射相似。

当肺叶中的多聚甲醛被溶液完全置换时，停止灌注。用镊子夹住心脏，剪断结缔组织韧带、血管和气管，小心取出肺脏。注意保持心脏与肺脏相连。

留出一个肺叶用于冷冻切片，其余肺组织用于全肺染色。将肺组织放入带有紧密封盖的塑料杯中，用2%甲醛和PBS固定。在肺组织上方放置一块纱布，以确保其完全浸入溶液中，室温下静置30分钟。

半小时后，移除固定液，并用 PBS 充分清洗组织 3 次。将 1 毫升 Xal 储存液按 1:40 的比例稀释于基础染色液中，新鲜配制现用的 Xal 溶液，并向杯中加入至少 10 毫升。用一块纱布将肺组织压入液下。松紧盖上盖子以允许气体交换，并在 37°C 避光条件下孵育 3 至 5 小时。

孵育结束后，去除xal溶液。用PBS冲洗肺组织一次，以去除残留的xal溶液，然后加入至少10毫升含4%多聚甲醛的PBS溶液。组织现可用于组织学分析，并可在4°C的4%PFA溶液中长期保存。

首先，在包埋模具中加入未稀释的 Poly Forze 包埋剂，填充至模具体积的三分之一。然后将肺叶放入模具中，并继续添加包埋剂直至完全覆盖肺叶。小心避免产生气泡，随后将包埋好的肺叶置于 4°C 下孵育 20 分钟。

接下来，将包埋的肺组织置于干冰与异戊烷混合物中缓慢冷冻，以备切片。如有需要，可将其转移至–80 °C超低温冰箱中保存。使用冷冻切片机对肺叶进行切片，厚度为7至10微米，并将切片贴附于市售的冷冻切片专用载玻片上。切片贴附后，立即在37 °C恒温、加湿的孵育盒中用Xal染色液孵育24小时。次日，用PBS缓冲液漂洗载玻片两次，每次5分钟。

随后用蒸馏水短暂冲洗。现在用核固红对切片复染10秒，以获得较浅的复染效果，使XAL更显突出，然后立即用蒸馏水冲洗掉复染液。如需更深的复染效果，可将复染时间延长至30秒或更久。

使用免疫封片剂封片。重新研究了在已建立的LM八小鼠骨肉瘤模型中转移灶的形成。通过本研究描述的方法，同时对经lucy转导和非转导的对照组及LM八细胞注射后的小鼠，获取其灌注与非灌注肺组织的代表性图像。

在未灌注和灌注的肺组织中，宏观和微观转移灶均未被检测到。但有趣的是，在注射了Dun LA Z细胞的小鼠中，Xgl染色显示未灌注肺表面存在单个细胞或小细胞簇组成的蓝色微转移灶。原位灌注并固定肺组织可进一步提高Dun LA Z微转移灶的可检测性；然而，在注射对照LM8细胞的小鼠中，未观察到微转移灶发展为宏观病灶。在未灌注的肺组织中，可识别出直径大于0.1毫米、呈半透明且几乎难以察觉的宏观转移灶。肺灌注并未改善这些病灶的检出。

然而，在注射了ate LAC Z细胞的小鼠中，非灌注器官表面检测到多个X-gal染色呈蓝色的大转移灶。在非灌注器官表面也检测到了微转移灶。此外，肺组织的灌注进一步提高了大转移灶和微转移灶的可检测性。

因此，由于灌注组织的透明度提高，器官表面下方的病灶也变得可见，导致微转移灶和大转移灶在数量上显著增多、密度更高。通过使用小鼠肺组织冷冻切片进行的额外组织学分析证实，在注射了经LAX Z转导的LM八细胞且原发性肿瘤来源于Dun LAX Z细胞的小鼠中，肺转移灶的检出率得到改善。在肺组织切片中可识别出微转移灶甚至单个细胞病灶。

在携带相应对照细胞原发性肿瘤的小鼠中未观察到此现象。此外，与对照LM八细胞的小鼠相比，注射LM八LA C细胞的小鼠中宏观转移灶也更为明显。观看本视频后，您应能充分掌握如何在ZI二小鼠中进行肺灌注和固定，以及后续对切除肺组织中转移灶的染色操作。

该技术是一种高度敏感的终点检测方法，可用于评估任何类型癌症研究中肺部的转移分布情况，也可作为当前用于早期检测转移病灶的活体成像技术（如微型CT、PET和MRI）改进的基准。