一种优化的荧光激活细胞分选（FACS）方法用于从胎鼠内脏器官中分离自主神经前体细胞

本实验的总体目标是从外周神经系统神经节中分离出一群纯化的神经前体细胞。首先从胎鼠中解剖出目标器官或特定的神经节，随后对组织进行部分解离，使单个细胞释放到周围的培养基中。

接下来，过滤细胞悬液以去除任何残留的组织团块或大块聚集体。最后，通过流式分选细胞悬液，根据目标细胞群体中荧光报告分子的表达情况分离出目标细胞群。最终，可比较不同发育阶段分离的前体细胞之间，或不同神经元细胞类型的纯化群体之间的基因表达模式。

与基于抗体标记分离细胞群体的技术相比，该方法的主要优势在于，针对特定基因表达细胞的免疫试剂往往不易获得。通过基因工程改造的小鼠品系可在特定的神经元亚群中表达荧光蛋白，从而实现这些细胞群体的分离。尽管我们在此演示了从肠道和口腔神经发生轨迹中分离神经前体细胞的方法，但该技术也可应用于表达荧光报告基因的其他模式系统。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为他们倾向于过度消化源组织，从而导致细胞活力下降。在开始解剖之前，应通过明场照明观察胚胎，以确保相关结构处于清晰对焦状态。随后使用荧光体视显微镜筛选荧光报告基因的表达，以鉴定携带转基因的阳性胚胎。

安乐死后，将胚胎置于解剖皿中，加入少量 PBS，以防止在解剖组织时胚胎漂浮。沿胚胎体侧及肝脏水平的腹部横向切开皮肤。将胚胎翻转至仰卧位，用精细镊子将其固定。

在前肢水平，于膈肌位置插入另一对镊子，然后迅速将内脏向下朝尾部方向拉扯，使其脱离背侧体壁，从而将肝脏至生殖结节之间的内脏组织去除。若胸腔器官（如心脏或肺）随内脏一同带出，应在继续操作前将其移除。

将腹腔脏器与尸体分离后，用镊子插入肝脏下方靠近胃的位置，轻轻将肝脏从肠管上剥离。然后小心地将后肠从背侧尿道分离，并将肠管从泌尿生殖道中移除。最后，翻转肠管，使脾脏位于胃下方可见。

取出脾脏和胰腺。通过抓住肠系膜将肠管各袢分开，然后轻轻牵拉肠系膜，将其及伴随的血管从肠管上剥离下来。

避免直接用镊子夹取肠道。如果肠道断裂，只需在解离阶段将各片段收集在一起。根据组织类型和胚胎表型类型，将每种组织类型分别汇集至含有冰上预冷的HBSS的15毫升锥形管中。

离心成团后，对分离的组织尽可能吸除全部 HBSS。然后将组织沉淀重悬于一至数毫升 ACU max 中。每个样品之间需更换移液器吸头。

为避免不同组织类型之间的交叉污染，将试管置于37摄氏度水浴中20至45分钟。根据所分离组织的阶段，组织的解离和过滤是该操作中最关键的步骤，需防止组织过度解离，否则会导致细胞活力降低。

限制解离时间，不要试图将所有组织块完全解离至一半时即停止。在解离过程结束前，通过用力将离心管撞击水浴锅侧壁，并以手腕快速甩动的动作使管子迅速向下挥动，手动打散组织。随后立即将解离后的样品置于冰上，并使用新的移液枪头为每管加入一毫升新鲜配制的终止液，上下吹打样品直至组织几乎完全解离。

现在使用一对经乙醇灭菌的镊子，将一块3厘米见方的38微米尼龙网膜覆盖在新的15毫升锥形管管口。然后使用窄孔吸头，将重悬的细胞溶液逐滴加入膜的中心，使其通过网膜过滤。细胞悬液过滤完成后，用1毫升淬灭液1:5冲洗样品管，并将残留的细胞一并过滤。

然后小心移除滤膜，防止任何未过滤的组织样本进入离心管。离心后，吸除细胞悬液的上清液，并将沉淀重悬于1毫升淬灭液（比例为1:5）中。随后将每份细胞悬液通过尼龙滤网过滤至5毫升聚苯乙烯试管中，操作方法如上所示。

首先，保留少量荧光样品用于仅EGFP的补偿对照。然后将野生型组织样品分为两部分，分别标记为仅野生型和七种A a d.Only。现在用淬灭剂一至五填充所有样品管，离心沉淀样品后，每管中除最后200微升上清液外，其余全部吸除。

最后，向待分选的样品以及仅含七AAD的对照样品中加入七AAD。然后向1.5毫升微量离心管中加入0.75毫升三唑LS。样品收集管首先使用对照样品设置补偿参数和分选门，以排除七AAD阳性的死亡细胞，并收集表现出高强度GFP荧光的细胞。

设置补偿参数后，使用宽孔喷嘴和低流速，以尽可能低的压力开始分选。每个微量离心管中最多收集 25,000 个细胞，以避免三醇 LS 被过度稀释。分选完成后，立即对捕获在三醇 LS 中的每管细胞进行涡旋振荡。

在本图中，显示了交配后15.5天的欧洲小鼠生殖道整体标本在明场照明下腹侧观的图像。同一标本在荧光照明下观察，以展示肾上腺及位于内侧的腹腔神经节中EGFP阳性细胞的分布情况，这些结构通过其酪氨酸羟化酶（TH）-EGFP转基因表达得以识别。此图为交配后15.5天TH-EGFP转基因小鼠膀胱经解剖后的侧向观，显示了盆腔神经节、膀胱壁及尿道中因转基因表达产生的荧光信号。

在此背侧视图中，相同的EGFP阳性细胞在前部背侧尿道组织中明显可见。将组织解离以制备用于流式分选的细胞悬液，需要在充分的酶消化与避免过度消化之间取得精细平衡，因为过度消化可能导致细胞活性降低。这些显微照片显示了在解离过程进行到一半时，下尿生殖道和肠道组织的状态。如这些照片所示，在经过适当消化的组织中，手工解离前后的器官亚片段仍清晰可辨；而若组织经酶处理时间过长或酶浓度过高，则组织完整性会明显受损。

然而，所得的悬液中不存在任何残留的较大组织碎片，经过适当的解离和手动过滤后，所获得的流式细胞术图谱通常显示超过90%的细胞具有活性，且在该活细胞群体中表达报告基因的细胞仍保持高强度的EGFP表达。黑色群体由单个死细胞组成，这些细胞因摄取了7-AAD荧光染料而被标记；灰色群体则根据前向散射和侧向散射特征被鉴定为单细胞，并且排除了7-AAD染料，因此属于活细胞。

绿色群体来源于门控的GFP阳性区域，由排除了七AAD的单个活细胞组成，并表现出EGFP荧光。通过该方法，可从其他外周组织（如交感神经链、背根神经节或肺）中分离神经元前体细胞，从而研究不同细胞群体间基因表达谱的差异或不同谱系发育的相关问题。