用于单分子成像的紧凑型量子点

本实验的总体目标是制备具有优化亮度和稳定性，并且尺寸小、非特异性结合少的荧光量子点，用于单分子成像。该目标的实现首先通过制备小尺寸的硒化镉量子点核心；第二步是将这些核心与汞进行合金化，以使其荧光红移至红光光谱区域并提高其亮度。

接下来，在纳米晶体上生长一层薄合金壳，以稳定其荧光发射。最后一步是使用多齿聚合物将这些颗粒从有机溶剂转移至水相缓冲液中，该聚合物可修饰上生物惰性的聚乙二醇。最终，通过荧光光谱法、凝胶色谱法和凝胶电泳法证明，这些颗粒具有明亮的荧光、紧凑的流体力学尺寸和中性的静电电荷，这些特性非常适合用于生物学中的单分子荧光成像。

与现有商用材料相比，这些量子点的主要优势在于其显著减小的流体动力学尺寸。尽管较小的量子点会受到荧光强度降低、荧光稳定性下降以及仅在蓝光谱范围内发光等不利影响，但我们通过汞阳离子交换工艺克服了这些效应。这些纳米晶体有助于通过在拥挤的生物环境中实现单个生物分子的动态成像，从而解答生物物理学和细胞信号传导领域中的关键科学问题。

首先，在无水无氧条件下，将硒加入50毫升三颈烧瓶中，通过高真空对烧瓶进行抽气，并使用Schlenk管线用氩气填充。加入10毫升TOP，搅拌并加热至100摄氏度，持续一小时，得到澄清无色的溶液，从而制备出0.4摩尔的硒TOP溶液。

将溶液冷却至室温，并将烧瓶放置一旁。同时，按照书面实验方案中列出的用量，在250毫升三颈烧瓶中配制氧化镉、TDPA和ODE的混合溶液。在本视频的指导下，一边搅拌一边使用旋蒸仪对溶液进行抽真空处理。

将温度升至100摄氏度，并继续抽真空15分钟。在氩气氛围下除去低沸点杂质，将混合物加热至300摄氏度并保持一小时，使氧化镉完全溶解。溶液颜色将由红色变为无色透明，随后将溶液冷却至室温。

接下来，将 HDA 加入镉溶液中，加热至 70 摄氏度并抽真空。当达到恒定压力后，升高温度并回流溶液 30 分钟。将 Schlenk 线的阀门切换至惰性气体，并将热电偶直接插入溶液中。

在无空气条件下，将 DPP 加入镉溶液中，并将温度升至 310 摄氏度。然后使用连接 16 号针头的一次性塑料注射器吸取 7.5 毫升 0.4 摩尔的上层硒溶液。当温度稳定在 310 摄氏度后，将温度控制器设为 0 摄氏度，并迅速将上层硒溶液直接注入镉溶液中。

溶液将从无色变为黄色、橙色，温度会迅速下降，随后再次升高至约 280 摄氏度。该步骤中最困难的部分是将注射器中的全部液体尽快注入镉溶液中，以确保颗粒均匀成核。

反应一分钟后，将烧瓶从加热套上取下，并用气流快速冷却，直至温度低于200摄氏度。当温度降至约40摄氏度时，加入30毫升正己烷稀释，大部分剩余的镉前驱体会从溶液中析出。通过离心去除该沉淀物。

在六个50毫升聚丙烯圆锥形离心管中，分别将12毫升所得的粗制纳米Krystal溶液用40毫升丙酮稀释。随后以相同参数离心，小心倾去并弃除上清液。接下来，将纳米Krystal沉淀溶解于己烷中。

用等体积的甲醇萃取溶液，保留上层相。第三次萃取时再重复此步骤两次。甲醇的体积可调整至约15毫升，以获得浓度约为200微摩尔的纯硒化镉量子点的浓缩正己烷溶液。

该反应的典型产率为三微摩尔的硒化镉晶体，直径为二至三纳米。通过测量紫外-可见吸收光谱来确定纳米晶体的直径和浓度，具体方法见书面实验步骤。可通过部分汞交换使纳米晶体的吸收和荧光发射发生红移。具体操作如下：在20毫升玻璃小瓶中加入搅拌子，混合正己烷和氯仿，然后加入硒化镉量子点溶液、油胺（OLA）和辛酸汞。按照书面实验步骤纯化纳米晶体并测定其浓度后，将纳米晶体在室温下静置至少24小时，以促进壳层生长。

在50毫升三颈烧瓶中配制0.1摩尔的壳前驱体溶液，在真空条件下加热镉前驱体、锌前驱体和硫前驱体溶液，回流一小时，得到澄清溶液，然后向三颈烧瓶中通入氩气。加入TOPO（三辛基氧化膦）和已制备的汞镉硒量子点。通过侧管在室温下抽除己烷。

将温度升至100摄氏度，回流15分钟。切换气路阀门至氩气，将热电偶插入纳米晶体溶液中。当温度升至120摄氏度后，加入0.5个单层或140微升的硫前驱体溶液，继续反应15分钟。

将温度升至140摄氏度。加入0.5个单层或140 µL的镉前驱体溶液，使反应继续进行15分钟。然后向反应溶液中加入500 µL无水OLA。

在160摄氏度下加入0.5个单层，或220微升硫前驱体溶液，随后在170摄氏度下加入等量的锌前驱体溶液，每次加入间隔15分钟。然后在180摄氏度下，以15分钟为间隔，分别加入0.25个单层，或150微升硫前驱体溶液和锌前驱体溶液。冷却至室温，并测定这些颗粒的新消光系数。

使用紫外-可见光谱，在假设纳米晶体数量未发生变化的前提下，将反应溶液作为粗产物混合物储存于冰箱中。在此阶段，可采用电子显微镜、紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法对纳米晶体进行表征。将纯化的核壳量子点加入50毫升三颈圆底烧瓶中，并在高真空条件下除去己烷。

为获得干燥薄膜，向烧瓶中通入氩气。加入无水嘌呤至纳米颗粒薄膜中，并在1至2小时内将浆液加热至80摄氏度。纳米颗粒将完全溶解。

向溶液中加入1毫升FIO甘油，在80摄氏度下搅拌2小时。将溶液冷却至室温后，加入0.5毫升三乙胺以使巯基甘油去质子化，并继续搅拌30分钟。由于极性纳米晶体在此溶剂混合物中溶解度较差，加入三乙胺后溶液可能变得浑浊。

将量子点溶液转移至含有20毫升正己烷和20毫升丙酮混合液的50毫升锥形离心管中，充分混匀。通过离心分离析出的纳米晶体，随后用丙酮洗涤沉淀物，将量子点沉淀物溶于5毫升DMSO中，并使用水浴超声处理，然后进行离心。为去除可能存在的聚集体，再通过紫外-可见吸收光谱测定纳米粒子的浓度。

纯量子点溶液应在三小时内使用，因为其表面的硫醇基团在空气环境中会缓慢氧化。用DMSO将量子点溶液稀释至10微摩尔或更低浓度，并转移至50毫升的烧瓶中。在搅拌条件下，将预先配制的5毫克/毫升聚丙烯酸DMSO溶液逐滴加入量子点溶液中，然后在室温下对溶液脱气处理五分钟。

用氩气吹扫量子点聚合物溶液，并在80摄氏度下加热90分钟。将溶液冷却至室温后，逐滴加入等体积的50毫摩尔、pH为8的钠盐溶液，搅拌10分钟。按照书面实验步骤纯化量子点，并通过紫外-可见吸收光谱测定其浓度。在4毫升玻璃小瓶中（内含搅拌子），将1摩尔量子点与硼酸盐缓冲液混合，加入40,000倍摩尔过量的750道尔顿单氨基聚乙二醇。

有关如何向纳米晶体添加特定化学功能的说明，可参见书面操作步骤。将新配制的活化剂溶液以25,000倍摩尔过量迅速加入量子点溶液中，并在室温下搅拌30分钟。重复此步骤四次，以使纳米晶体表面充分饱和地结合PEG。

最后，加入200 µL的1摩尔Tris缓冲液以终止反应，随后通过透析离心滤器或超速离心进行纳米晶体的纯化。所得纳米晶体可通过液相色谱、凝胶电泳和荧光显微镜分析其单分散性、流体动力学尺寸和表面电荷。图中展示了硒化镉纳米晶体、经阳离子交换后的汞掺杂硒化镉纳米晶体，以及壳层生长后的核-壳结构汞镉硒化物/硫化锌纳米晶体的代表性吸收光谱和荧光光谱。其中，核部为硒化镉的纳米晶体荧光量子产率接近15%；然而，在汞交换后，该效率下降至1%以下，这可能是由于表面原子结构破坏引入了载流子陷阱所致。

生长一层硫化镉锌薄壳可将量子效率提升至70%以上，且在转移至水中后仍能基本保持该效率。相比之下，不含汞的硒化镉核、硫化镉锌壳纳米晶体在水中会损失大量量子产率，除非生长出较厚的外壳。需要注意的是，由于电子载流子泄漏到壳层材料中，硫化镉锌包覆会导致光谱发生红移。

对于核为镉的纳米晶体，这种红移约为20至30纳米，并随着核中汞含量的增加而增大。因此，通过将汞掺入纳米晶体核心，可以在不牺牲亮度的情况下保持纳米晶体的较小尺寸。这一较小尺寸在此处的透射电子显微图像以及汞-镉-硒核、镉-锌硫化物壳纳米晶体的粒径分布中得到证实，其平均直径为3.2±0.6纳米。

采用两步相转移至水相的方法对于获得均一的纳米晶体群体至关重要，该方法无需进一步的尺寸筛选即可去除聚集体和团簇。此处所示的尺寸排阻色谱图证实，其尺寸与伴白蛋白相似。在分子量为75千道尔顿的基础上，经750道尔顿的氨基-PEG修饰后，尺寸仅增加至12纳米，与IgG抗体的尺寸相近。

PEG 修饰可中和表面电荷，这一点已通过此处所示的琼脂糖凝胶电泳实验得到证实。图中以箭头标示加样孔，右侧标明电极极性，显示在偶联前，纳米晶体以带电粒子形式迁移，而经 PEG 修饰的纳米晶体则呈静电中性。图中所示为将这些纳米晶体沉积于玻璃盖玻片上，并用 545 纳米可见光激发后获得的落射荧光显微图像。利用电子倍增 CCD 相机，可在每秒 30 帧的速率下轻松观察到单分子水平的这些纳米晶体。

该图显示，在持续激发下，每帧中观察到的荧光颗粒数量随时间发生波动。这是由于闪烁和光降解共同作用所致。在前七分钟内，闪烁占主导地位，随后氧化性光降解逐渐显现。

观看本视频后，您应能充分理解如何化学合成量子点、如何将其转移至水相缓冲液中，以及如何对其进行修饰以用于生物成像应用。请务必注意，使用含镉和汞的试剂可能具有极高危险性，应采取额外预防措施以避免个人接触。