利用LysoTracker检测胚胎及分化中的胚胎干细胞的程序性细胞死亡

以下实验步骤的目的是演示如何利用Lyo Tracker染料维持两种样本——小鼠胚胎和已分化的干细胞——中的溶酶体，以检测细胞死亡模式。制备胚胎样本时，首先通过手术分离胚胎，并将其置于培养皿中以准备获取已分化的细胞。胚胎干细胞则用于生成拟胚体。

这些胚胎体在悬浮培养后，接种于腔室载玻片上形成单层细胞。所有胚胎单层细胞均可在溶酶体示踪红色染料（Lysotracker Red）中孵育，随后洗涤并固定样本，然后进行拍照，以观察和定量染色结果。所获得的结果显示了Lysotracker染色情况。该染色是一种简单的方法，可用于检测胚胎及培养细胞中的程序性细胞死亡。

与现有的隧道分析等方法相比，该技术的主要优势在于，由于OT追踪染料是一种小分子，因此可以快速且简便地检测厚组织。尽管该方法可揭示小鼠胚胎和分化培养物中程序性细胞死亡的模式，但也可应用于其他组织类型，如鸡胚和正在分化的成体干细胞。将年轻的雌性小鼠与种鼠雄性小鼠配对，并在次日早晨检查阴道栓，以确认交配是否发生。

阴道栓出现当天的中午相当于0.5天。在感兴趣的胚胎发育日，按照批准的方案对雌性动物实施安乐死，并将其子宫取出置于含Hank's BSS的10厘米培养皿中，冲洗去除血液。分离胚胎并从子宫中取出。

去除胚外膜，并用Hank's BSS至少清洗一次，以去除多余组织和血液。在清理过程中，将已解剖的胚胎保持在冰上。其余的胚胎同样处理。

制备5毫升Liso tracker胚胎染色液。该体积足以用于一次或两次胚胎收集。轻轻混匀溶液以分散染料，然后将胚胎转移至该溶液中，并在37摄氏度下孵育45分钟。

孵育结束后，用 Hank's BSS 轻柔地冲洗胚胎，每次 5 分钟，共冲洗 4 次。冲洗过程应轻柔进行，以免损伤组织。去除液体时，需缓慢操作，并密切注意脆弱胚胎的位置，始终保留一部分液体覆盖胚胎。

然后将胚胎在4%多聚甲醛中固定过夜。次日，用Hank's BSS溶液冲洗胚胎一次，每次10分钟，以去除固定剂。接着通过甲醇梯度脱水以消除背景染色。

此步骤可提高成像前储存过程中的信噪比。如有需要，可从每个胚胎中采集组织样本用于遗传学分析。随后，在基因分型前将组织样本重新水化。

将胚胎分别放入带有与组织样本对应标签的独立试管中。现在可将分离的胚胎在-20 °C的甲醇中无限期保存，需避光。

首先通过悬滴法制备胚状体。以每20微升液滴500个细胞的起始密度培养三天后，将胚状体转移至10厘米非黏附性培养皿中进行悬浮培养。继续培养五天，此后每两天更换一次培养基。

将胚体转移至明胶包被的八孔载玻片中，每个孔内放置一个或两个胚体。继续培养胚体10天。此后每隔一天更换一次培养基，轻轻吸去原有培养基，向每个孔中加入300 µL Lyo tracker细胞染色溶液。

手动移除培养基时需小心操作，将移液枪枪头置于小室的角落处。这样可以避免意外将仍附着在玻璃表面的细胞刮落。再次添加培养基时，同样将移液枪枪头置于小室的角落，并缓慢加入培养基。

将培养室在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。然后用 DPBS 漂洗两次，每次漂洗 5 分钟。现在于室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟。

然后用 DPBS 进行两次五分钟的漂洗，以去除固定剂。为了封片胚胎，将其置于深凹载玻片或小型培养皿感染防护罩中。通过吸除 DPBS 来准备用于显微镜观察的细胞样品。

从载玻片上取下小室，静置约五分钟使其自然风干。用铝箔覆盖以保护荧光染料。然后加入水溶性封片剂（如含DAPI的Vector Shield），再盖上盖玻片。

现在载玻片已制备完成，可进行成像。使用配备有罗德胺、道明或德克萨斯红滤光片的解剖显微镜或复式显微镜观察样品。染色通常非常明亮，因此在手动模式下通常不需要长时间曝光。

在相同的曝光条件下对所有样品拍摄数码照片。为量化图像，在 Adobe Photoshop 或类似的成像软件中打开图像。为确定脂质染料（lyo tracker）染色量，请选择红色通道。

通过直方图功能查看并记录整幅图像的像素数量。随后对图像进行阈值处理，使红色染色区域由白色像素表示。此操作将图像转换为黑白图像。

选择一个阈值水平，并对整组图像使用该阈值。使用颜色范围工具选择白色像素，并通过直方图函数获取白色像素总数。使用蓝色通道统计视野中细胞核的数量。

通过标注图像来记录计数值，并记录这些数值以用于计算每个细胞的平均染色水平，这可能是有益的。对所有剩余图像使用相同的阈值设置重复此分析。为了进行取样，使用了 Lyo Tracker 对音猬突变胚胎进行染色。

由于Ly O示踪剂是一种小分子且具有高度扩散性，可在整个胚胎内部深层区域进行染色。在受精后10.5天的胚胎中，音猬因子（sonic hedgehog）基因缺失突变体胚胎的程序性细胞死亡（PCG）显著增加，尤其在肢芽和某些脑区表现明显。肢芽通过整体装片在更高倍镜下成像，以评估其整体分布模式。分离的组织部分还使用振动切片机进行了切片观察。

箭头指向在冰冻切片机切取的切片中，Sonic hedgehog 基因缺失的远端尖端染色增强的区域。在这些切片中，TUNEL染色与OT Tracker联合使用。尽管TUNEL染色与OT Tracker染色之间并不存在严格的逐一对映关系，但在高倍镜下，程序性细胞死亡（PCD）的大致区域存在显著重叠。可以观察到一些细胞孔洞仅在TUNEL检测中呈阳性染色，而未被OT染料标记；另有一些孔洞仅被OT染料标记；还有一些孔洞则呈现两种染色重叠的现象。经过10天的胚胎体培养后，细胞分化为多种细胞类型，包括神经元、肌细胞和心肌细胞。

在分化 ES 细胞的正常培养中，通过溶酶体追踪剂和 TUNEL 检测可观察到少量细胞发生了程序性细胞死亡。随后用过氧化氢处理细胞以诱导氧化应激性细胞死亡。与未处理组相比，低剂量过氧化氢处理使溶酶体追踪剂和 TUNEL 染色均有所增加。

与胚胎中的结果类似，两种染色均标记了共有和独特的细胞。高剂量过氧化氢导致细胞收缩，以及更广泛的OT示踪剂和TUNEL阳性信号。作为对照，采用血清饥饿处理诱导自噬，即在血清饥饿一小时后进行诱导。

OT tracker 染色增加，但 TUNEL 阳性率仍处于正常水平。因此，尽管 reer 操作简便且具有实用性，但在样本定量后，仍需通过其他检测方法进一步验证染色结果代表的是细胞凋亡还是自噬。

采用先前演示的简单 Photoshop 方法，结果证实，随着过氧化氢浓度的增加，溶酶体示踪染色水平也随之升高。如果操作得当，掌握此染色程序后，整个过程可在两小时内完成。在此步骤之后，还可采用其他方法，如 NX-5 或 LC3 免疫染色，以确认细胞死亡的类型。请注意，目前 Tracker Green 仅适用于活细胞，因此对于需要固定的样品，Reca Red 是最佳选择。