一种通过表达克隆研究Grb2信号复合物的高内涵成像工作流程
2012年10月30日
一种用于鉴定新型具有信号传导能力的跨膜受体的高内涵筛选方法被描述。该方法适用于大规模自动化，并可对受体功能进行预测 体内 蛋白质结合及蛋白质复合物在哺乳动物细胞中的亚细胞定位。
以下实验的总体目标是通过cDNA表达克隆技术并观察绿色荧光蛋白标记的Grab two蛋白的变化，来鉴定与Grab two相互作用的分子伴侣。该目标首先通过从细菌裂解液中制备cDNA文库来实现，这是第二步。随后将这些cDNA转染至人胚胎肾细胞中，从而实现报告基因构建体与目的基因的共同表达。
接下来，将转染后的培养板置于Opera显微镜下进行分析，以观察Grab two在细胞内定位的变化。根据荧光显微镜结果，可获得表皮生长因子受体介导的、GFP标记的Grab two向早期内体募集的现象。与酵母双杂交等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够在生理条件下鉴定Grab two的相互作用蛋白，同时考虑相互作用蛋白的亚细胞分布情况。
尽管该方法可用于鉴定由Grab two介导的信号转导，但也适用于其他系统，例如其他目的蛋白。cDNA文库以单个细菌克隆的形式提供，保存于甘油 stocks 中。
使用 Hudson Rapid Pick Light 的点样菜单中的 re ray 命令，在 96 孔板中操作。从源板中挑取细菌克隆，并接种到含有 1.5 毫升 LB 氨苄青霉素的 96 深孔板中。用透气封膜密封深孔板，于 37 摄氏度摇床中过夜培养。次日，将含有细菌的深孔板在 2000 转/分钟下离心 20 分钟。
使用台式离心机中的板适配器，吸出孔中的培养基，保留完整的细菌沉淀。接下来，按照此处所示配置 Tecan Freedom Evo 自动化工作站的台面。将质粒制备所需的溶液分别加入第 1 至第 5 个槽中，并在台面上放置一块深孔板。
将含有铝硅酸盐溶液的多孔槽放置在深孔板旁边，并将吸头装入吸头架中。组装真空抽滤装置。将质粒结合板放入真空抽滤装置内，质粒过滤板置于装置顶部。用 250 µL 溶液一重悬沉淀颗粒。
通过上下吹打使沉淀重悬于Resus悬浮缓冲液中。确保沉淀完全重悬对该实验步骤的成功至关重要。若上下吹打无法完全重悬沉淀，可使用摇床进行辅助。
加入250微升裂解缓冲液后，充分重悬菌体沉淀。密封培养板并倒置，以确保充分混匀。设定计时器为两分钟。
接下来，加入 350 µL 的溶液三，即中和缓冲液。密封反应板并倒置混匀三次。
将细菌裂解液转移至质粒滤板中。施加真空持续五分钟。移除滤板，并将结合板置于多通道装置顶部。
抽真空1分钟。加入500微升额外洗涤缓冲液，抽真空2分钟。加入900微升洗涤缓冲液四，抽真空2分钟。
随后，再次加入 900 微升洗涤缓冲液四，并抽真空 15 分钟。将 DNA 收集板放入层析柱装置中。向结合板中加入 100 微升洗脱缓冲液，并孵育 2 分钟。
抽真空10分钟。最后，取下收集板，使用NanoDrop 8,000测定DNA浓度。采用此方法，通常可获得约100纳克/微升的产量，可用于开始本实验。
将HEK 293细胞经胰蛋白酶消化并计数后，使用自动分液器将每种2 × 10⁴个细胞分装至每孔的PerkinElmer View板中，在37°C及5%二氧化碳条件下培养过夜，用于转染。
使用自动化液体处理仪，在圆底 96 孔板的每个孔中制备以下混合液：100 纳克 GFP。取含有 100 纳克 CD NA 的两种质粒 DNA，溶于 25 微升无血清培养基中。接着，向每孔加入 25 微升含有 0.5 微升转染试剂的无血清培养基混合液，并启动计时器，孵育 30 分钟。
30分钟后，将50微升cDNA转染混合物加入细胞中，采用轻柔的加样方法。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜。
开始图像采集时，启动 opera 软件。选择配置选项卡，并选择 20 倍物镜和正确的板型。确保物镜上的镜环设置为正确值，以便能够根据不同板型进行聚焦。
接下来，选择显微镜选项卡。将曝光一定义为 fite 4 88 激光，曝光二定义为 UV 365 激光。在两次曝光中均激活紫外滤光片，并分配曝光。
将曝光一连接至相机一，曝光二连接至相机二。将曝光一的曝光时间设为800毫秒，曝光二的曝光时间设为40毫秒。
二、选择曝光，将一个聚焦高度设为零微米。聚焦后选择聚焦。对相机一进行曝光。
调整焦面高度以优化曝光平面，然后单击“获取高度”。保存曝光参数，并重复进行曝光。二、选择实验定义选项卡，创建布局和子布局。
拖放相关的布局、曝光、参考图像、倾斜度、裁剪文件和子布局。保存实验。选择自动实验选项卡，并在正常条件下采集图像。
Grab two 在整个细胞内均有定位。当生长因子受体受到刺激后，它会转位至质膜，并随后被内化进入内体。在本图中，上方图显示了瞬时转染了 GFP-Grab two 的 CO M six 细胞，正如预期，荧光信号分布在细胞的整个区域。
然而，在瞬时转染了GFP抓取蛋白2以及细胞表面受体IT EGFR抓取蛋白2的细胞中，后者会重定位至类似内体的结构，如底图所示。因此，当使用全基因组文库时，可望鉴定出新的与抓取蛋白2结合的细胞表面蛋白。该方法不仅限于细胞表面蛋白的检测。
例如，GPA 的 DYNAMIN2 参与介导 GRAF2 的内吞作用，可诱导 GRAF2 发生转位。在本实验中，将 GFP-GRAF2 与 DNM2 共转染入 HEC293T 细胞。红色圆圈内细胞显示了 GFP-GRAF2 转位至类似内体结构的现象。
通过此实验步骤后，可进一步采用免疫共沉淀或生物化学检测等方法来回答更多问题，例如该相互作用是直接还是间接的。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用表达克隆技术来鉴定亚细胞水平的蛋白质相互作用。
概述
本文介绍了一种基于显微镜的检测方法，通过监测GFP标记的Grb2在哺乳动物细胞中亚细胞定位的变化，来鉴定Grb2的蛋白相互作用伙伴。该方法结合cDNA表达克隆、自动化转染和高内涵荧光成像技术，可直观显示在不同刺激或共表达蛋白条件下，Grb2向细胞膜和内体的募集过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 信号转导
- 蛋白质-蛋白质相互作用
背景
- 生长因子受体通过严格调控的信号转导通路来调节细胞增殖和分化。
- Grb2 是一种模块化衔接蛋白，可将活化的受体与下游信号级联（特别是 SOS-Ras-MAP 激酶通路）连接起来。
- Grb2 通过其 SH3 结构域与受体上的磷酸化酪氨酸残基相互作用，并组成性地与 SOS 相关联。
- 酵母双杂交等传统方法无法提供哺乳动物细胞中蛋白质相互作用的空间信息。
研究目的
- 开发一种简单且高内涵的显微成像检测方法，用于鉴定哺乳动物细胞中Grb2的相互作用蛋白。
- 通过与cDNA文库中的候选蛋白共表达，可视化并定量分析Grb2定位的变化。
- 实现全基因组范围内筛选新的Grb2结合蛋白及复合物。
使用的方法
- 以96孔板格式从细菌克隆制备cDNA文库。
- 自动化质粒DNA提取与定量。
- 利用自动化液体处理技术，将GFP-Grb2和cDNA构建体转染至人胚胎肾（HEK293）细胞。
- 采用高内涵荧光显微镜（Opera系统）监测活细胞中GFP-Grb2的定位。
主要结果
- 在基础状态下，GFP-Grb2 分布于整个细胞中。
- 当与活化的 EGFR 共表达时，GFP-Grb2 转位至类似内体的结构，表明其被招募至质膜并随之发生内化。
- 与其他蛋白（如 DNM2（Dynamin 2））共表达也可诱导 Grb2 重新定位，表明该检测方法能够识别多种相互作用伙伴。
- 该方法可在生理条件下鉴定与 Grb2 结合的细胞表面及细胞内蛋白。
结论
- 这种基于显微镜的检测方法能够直接观察哺乳动物细胞中 Grb2 蛋白在其亚细胞位点上的相互作用。
- 该方法适用于蛋白质-蛋白质相互作用的高通量、全基因组范围筛选。
- 它可提供有关蛋白质复合物形成的定性与定量数据，是对传统生物化学方法的有力补充。
常见问题
行业应用价值
通过表达克隆技术对Grb2信号复合物进行高内涵成像，可直接可视化哺乳动物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，支持早期靶点验证和机制层面的风险评估。该工作流程可提供关于信号复合物形成的定量且具有空间分辨的数据，从而在从发现到先导化合物筛选的关键转折点提升预测的可信度。该方法广泛适用于肿瘤学和细胞信号转导研究中信号通路靶点的项目筛选与优先级排序。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过在生理环境下绘制 Grb2 相互作用网络，实现对治疗假设的验证。
- 通过在活体哺乳动物细胞中可视化亚细胞定位和复合物形成，支持生物学风险评估。
- 通过定量评估蛋白质的招募和重定位，促进功能靶点的验证。
- 提高在发现管线中推进信号通路靶点的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为蛋白质-蛋白质相互作用的高内涵筛选制备经过验证的细胞系统。
- 标准化检测条件，确保在cDNA文库中获得可重复、定量的成像结果。
- 实现可扩展的全基因组范围筛选，鉴定新的Grb2结合蛋白以供下游评估。
- 通过提供稳定的定位读出信号，支持可靠的化合物或遗传扰动筛选。
转化与临床前研究
- 通过在哺乳动物细胞中模拟Grb2的募集，与疾病相关的信号通路保持一致。
- 通过实现后续生化验证，提供从发现到临床前验证的连续性。
- 在投入体内模型之前，降低对作用机制假设的风险。
- 有助于识别与Grb2信号动态相关的转化生物标志物。
流程与工作流整合
该高内涵成像工作流程整合了从早期发现到先导化合物鉴定的各个环节，支持基于假设和无偏见的筛选策略。
- 发现生物学：通过可视化多种刺激下Grb2复合物的形成，实现假设验证和信号通路的阐明。
- 筛选：提供适用于高通量鉴定相互作用伙伴的检测就绪性和可重复性。
- 分析：提供定量的定位与招募参数，用于比较不同实验条件。
- 转化研究：支持生物标志物的对接以及向临床前研究的机制连续性延伸。
- 企业级复用：提供可重复使用的成像与表达克隆平台，可适配于其他信号蛋白的研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：在哺乳动物系统中实现蛋白质相互作用筛选的标准化和规模化。
- 战略价值：通过优先选择已验证的靶点，为立项或终止决策提供依据，提升资金使用效率。
- 组合影响：支持对信号通路相关资产进行风险调整后的推进或筛选。
实施注意事项
- 需要具备高内涵成像、细胞培养和分子克隆方面的专业知识。
- 需要能够使用自动化液体处理系统、荧光显微镜和图像分析基础设施。
- 要求跨团队对检测方案和数据分析标准进行统一。
- 通过适当的设计构建，可适用于多种哺乳动物细胞系和信号蛋白。
- 依赖于稳定的图像采集和定量分析流程，以获得可靠的结果。
