凝血酶处理与对照人肺微血管内皮细胞转录组的RNA-seq分析

本实验的总体目标是全面、详细地展示如何应用RNA-Seq这一强大的新一代DNA测序技术进行转录组分析。首先，从经或未经凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞中分离总RNA，并检测RNA质量；第二步，利用这些RNA样本构建DNA文库。

使用 cbot 仪器简化簇生成过程，并在 HighSeq 1000 上进行 DNA 测序。随后进行数据分析，以最终识别并展示差异表达的基因转录本。最后一步是通过 RT-PCR 验证 RNA-seq 结果。与现有的转录组分析方法（如 DNA 微阵列）相比，IC 的主要优势在于，IC 能够对完整的转录组进行分析，提供数字化类型的数据，并且不依赖于任何已知的基因组信息，从而实现对细胞中基因表达的全面表征。

尽管检测mRNA水平是研究细胞转录机制如何受外界信号影响，或比较细胞在健康状态与疾病状态之间差异的有效工具。在本实验方案中，我们将展示对凝血酶处理组和对照组人肺微血管内皮细胞进行转录组的IC分析。该方案基于我们近期发表的研究，在该研究中，我们利用高通量测序平台High SEQ 1000上的RNA-Seq技术，成功完成了首例人肺微血管内皮细胞在凝血酶处理后的全转录组分析。Mrs.

Shaha Suman 将演示在高通量 SEQ 1000 仪器上进行的 DNA 测序，以及 R-T-P-C-R 验证实验。Denova 博士将使用 VS7 R-T-P-C-R 系统，演示人肺微血管内皮细胞的凝血酶处理及总细胞 RNA 的提取。Gibson Margaret 女士将演示 Experian 系统，用于检测 RNA 质量和 DNA 文库，以及在 cBot 上进行簇生成。

接下来，Dimitri Gregor 博士将演示数据分析。首先，将人肺微血管内皮细胞在含有 5% FBS、生长因子和抗生素的 EGM-2 培养基中，于 6 孔板中培养至 90% 到 100% 汇合度。在给予凝血酶处理前 30 分钟，更换为饥饿培养基。

30分钟后，用0.05单位/毫升的凝血酶处理细胞，或不作处理作为对照。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育6小时。经过6小时处理后。

使用Nirvana试剂盒，按照制造商说明书从经处理和对照的细胞中分离总RNA。在Experian自动化电泳工作站上，根据标准操作流程，利用Experian标准型真核生物RNA芯片评估RNA质量。最后，采用标准的分光光度法对RNA进行定量，用于文库构建。

以每份样品一微克高质量的总RNA作为起始材料构建文库。遵循制造商的标准操作流程。在本方案中，进行两轮含poly的Mr.mRNA筛选。

为了去除RNA，以尽量减少RNA测序，使用Experian DNA 1K芯片在Experian自动化电泳工作站上按照标准方案评估文库质量。使用定量实时聚合酶链式反应对文库进行定量。

按照书面方案中所述的简化Q-R-T-P-C-R步骤进行操作。在本视频的配合下，根据cyber green MM方案运行Q-R-T-P-C-R，并计算每个文库的原始储备浓度。将文库储备液稀释至10纳摩尔，并在20摄氏度下保存。

准备对流动池进行簇生成时，将cBot试剂板在水浴中解冻。CBOT是一种用于简化簇生成过程的仪器。清洗cBot仪器后，通过先混合13微升的一种XTE与6微升10纳摩尔的溶液，对文库进行变性处理。

随后，向每支试管的一侧加入1 µL 1 N 氢氧化钠，涡旋混匀，离心沉降，并在室温下孵育5分钟。然后将变性的文库置于冰上。接下来，用预冷的杂交缓冲液稀释变性文库，具体方法为：将996 µL缓冲液与4.0 µL变性文库混合，得到终浓度为12 pM的溶液。

将变性稀释后的文库放置于指定位置。然后翻转cbot板的每排试管，确保所有试剂均已完全解冻。离心板后，移除氢氧化钠试管排的铝箔封膜，并将试剂加载至cbot分液装置中。

将稀释后的变性文库各120微升加入标记为一至八的条状管中。每管加入1.2微升稀释后的变性PHI X对照文库作为加标对照。涡旋混匀后离心，按正确方向将条状管装载到cbot上，使一号管位于右侧。

将流动池和管路安装到cbot上。完成流路检查后，开始簇生成运行。运行完成后，检查所有通道的试剂输送情况。

记录任何异常情况。可立即开始测序运行，或将流动池置于提供的管中，在 4°C 下保存。开始测序。

解冻边合成边测序试剂。将试剂加载到试剂托盘的相应位置，注意不要触碰其他试剂。接触裂解混合液后，使用非测序用流动池彻底冲洗试剂管路两次，然后用70%乙醇和无尘纸清洁测序流动池，再用70%乙醇和镜头纸擦拭。

检查流动池是否存在任何条纹，如有必要则重新清洗。将流动池装载到测序仪上，并进行流路检查，以确保歧管与流动池之间的密封紧密。启动测序运行。

在运行过程中，随着质量指标的获取，持续监测运行期间的信号强度。完成101个循环后，进行反向链合成以完成第二轮测序读取。

首先加入配对引物和试剂，然后加入第二读长测序缓冲液。接着加载试剂，继续测序并运行评估。其次，在测序运行过程中检测第二读长的信号强度 Q3 及其他质量指标。

开始数据分析时，使用最新版本的cassava将碱基识别文件转换为FASTQ文件。将FASTQ簇计数设置为零，以确保生成单个FASTQ文件。对每个样本，解压缩FASTQ文件以进行下游分析。

使用最新版本的 TopHat 进行成对比对，该工具利用超高通量短读长序列和 SAM 工具将 RNA-Seq 读段比对到哺乳动物规模的基因组，SAM 工具可实现对 SAM 格式比对结果的多种后续处理功能。参考人转录组可从 I Genomes 下载。运行 TopHat 时采用所有默认参数设置，包括将文库类型选项设为片段无链特异性。使用 Cufflinks 软件包中的 Cuffdiff 程序，比较凝血酶处理的细胞与对照细胞。

基于人类参考转录组，筛选经凝血酶处理细胞中差异表达的基因转录本。然后使用电子表格以表格形式可视化结果。本实验中采用所有默认参数设置，并过滤掉 FPKM 小于 0.05 且 p 值大于 0.05 的基因转录本，以在无参考序列的情况下运行 Cufflinks 来检测新的异构体。

使用 cuffcompare 将样本转录本文件与参考基因组进行比对。利用 cuffdiff 进行差异表达分析，其中一次分析以合并的凝血酶转录本文件作为参考基因组，另一次分析则以合并的对照转录本文件作为参考基因组。同样，使用电子表格以表格形式可视化结果。与之前相同，过滤掉 FPKM 小于 0.05 且 p 值大于 0.05 的基因转录本。

在此步骤之后，研究人员可选择将新报道的转录本列表上传至 uc SC 基因组浏览器网站，通过人工检查验证其有效性。差异表达基因列表也可提交至 Ingenuity 通路分析系统，用于表征凝血酶处理所影响的基因和通路。在此步骤中，研究人员可选择使用 cummerbund——一种 R 软件包，专为辅助和简化 cufflinks RNA-seq 输出结果的分析任务而设计，以帮助管理、可视化和整合 cuffdiff 分析产生的全部数据。

随后通过定量逆转录聚合酶链式反应（QRT-PCR）验证RN aeq结果：首先，从对照组和凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞中提取总RNA，并进行RNA质量评估和定量分析，具体操作如本视频前面部分所示。然后，按照生产商说明书，使用Superscript III第一链cDNA合成系统，以每份样品1微克总RNA为模板合成互补DNA（cDNA）。最后，采用本视频配套书面方案中列出的TaqMan定制核苷酸探针，在ViiA 7实时PCR系统上进行QRT-PCR分析，并按照其中所述方法进行定量检测。

28S 与 18S 的比值传统上被用作 RNA 降解程度的指标。为了更准确地量化降解情况，仪器系统会计算一个 RNA 质量指数（RQI）。RQI 算法将 RNA 样本的电泳图谱与一系列标准化的降解 RNA 样本数据进行比较，并自动返回一个介于 10 到 1 之间的数值。RNA 样本的 RQI 值应至少为 7，理想情况下应大于 8。

这些 Experian 结果表明，RNA 样本质量较高，RQI 为 8.4。文库应在约 250 至 300 个碱基对处出现宽峰，如本图所示的高质量文库的 Experian 结果。此处展示了标准曲线样本和一个未知样本的 Q-R-T-P-C-R 结果。

在整个测序运行过程中，应持续观察测序的进展和质量。该图显示了第一循环成像步骤中的合适簇密度。这是运行的首个提示。

优质的簇应明亮且聚焦清晰。此处展示的是完成第一个循环后生成的第一个碱基报告示例。在此阶段，评估估计的簇密度强度水平和聚焦质量至关重要。

此处显示的是经过第四个循环后的下一个质量检查点。该图显示了每个通道的绝对簇密度。在第13个循环之后，每平方毫米的簇密度不应超过850 K。

计算簇的相位和前相位统计数据。典型数值介于 0.1 至 0.25 之间。在第 24 个循环后可进行主要的质量评估，此时将计算多项质量指标。

Q3以上读段所占百分比是衡量碱基可信度的指标。当读段的Q值为3时，意味着该碱基判定错误的概率为千分之一。随着测序运行的进行，Q值会逐渐下降，但初始阶段应有超过95%的读段达到或超过Q3。通过滤过筛选（passing filter，简称pf）的簇是实际获取测序数据的簇。

理想情况下，该值应高于 85%。簇的 pf 值基于多个因素，包括相位、预相位强度和 Q3，且在运行过程中不会发生变化。比对率是指实时比对到 FI x 基因组的读段所占的比例。由于在样本文库中加入了约 1% 的 FI x 文库，因此比对率应在 0.5% 至 1% 之间。

该统计数据表明，文库内容在聚类中得到了良好体现，且此处列出的聚类不存在偏差，展示了对照组和凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞中的表达基因及转录异构体。值得注意的是，共检测到约 26,000 种新异构体，这体现了 RN aeq 技术的强大能力，其能够识别未知的 RNA。

此外，可变剪接转录本和替代启动子的使用情况无法通过微阵列技术检测到。RNA-Seq 还能够检测那些在微阵列中定量不准确或未被检测到的低丰度转录本，从而通过替代方法验证 RNA-Seq 的结果。为验证 RNA-Seq 数据中的三个不同基因，进行了 A-Q-R-T-P-C-R 实验，其中 TR 基因的表达水平上调了 7.96 倍。

其中一个基因在qRT-PCR数据中下调了1.16倍，另一个基因下调了1.70倍，而RNA-Seq检测到的相应变化倍数分别为上调7.25倍、下调1.15倍和下调2.07倍。这三个基因在RNA-Seq和qRT-PCR中的检测结果高度一致，验证了RNA-Seq结果的可靠性。本实验方案针对的是经凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞在某一时间点的IC研究，但可轻松扩展至多时间点研究，或用于其他细胞、组织在不同刺激物或抑制剂处理下的研究，也可用于比较健康状态与疾病状态下细胞或组织的转录组差异。

尽管本方案专用于High SQ 1000，但也适用于任何HighSeq系列或基因组分析仪。这两种仪器在簇生成步骤和测序试剂上仅有细微差异。其他新一代DNA测序平台，例如SOLiD系列，亦可参考本方案。

GS 系统以及一些新兴的较新系统也已用于 RNA-Seq。尽管它们的文库构建和测序流程可能略有不同，但本实验方案中提供的 RNA 操作技巧、数据分析部分以及通过 RT-PCR 进行的验证，可为其 RNA-Seq 应用提供参考价值。