为条件性敲低基因表达及检测其对E4orf4诱导细胞死亡的影响制备细胞系

以下实验的总体目标是观察ACF1或SNF2H基因敲低对E4orf4诱导的细胞死亡的影响。该目标通过构建细胞系来实现：在这些细胞系中，通过添加多西环素条件性激活ACF1或SNF2H的shRNA表达，从而导致ACF1或SNF2H蛋白水平降低；第二步，对已获得的细胞系进行处理，一部分用多西环素处理以降低ACF1或SNF2H的表达，另一部分则不作处理。

为了研究ACF1或SNF2H对E4OR4诱导的细胞死亡的影响，在表达或不表达S-H-R-N-A抗性ACF1或SNF2H的细胞中检测了E4OR4的表达。通过JY检测法计数具有凋亡形态的细胞核，获得的结果显示了ACF1或SNF2H水平对E4OR4毒性的效应。该技术相较于其他方法（如RNA的瞬时转染）的主要优势在于，所有细胞均表达S-H-R-N-A，且与传统质粒共表达的细胞比例更高。该方法不仅有助于揭示E4OR4诱导细胞死亡的潜在机制，还可应用于其他促凋亡蛋白的研究。

除了Ana Lafe之外，我实验室的另一位研究人员也将演示该实验的部分操作步骤。首先，为建立可诱导的细胞系，将T-Rex 293细胞以约每10厘米培养皿5×10⁶个细胞的密度接种于8 mL含有血清的DMEM培养基中，培养基中不得含有四环素，并添加5 µg/mL的blaster aside。将培养皿置于37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，在转染前更换为8 mL新鲜培养基。用于转染的质粒为P-superior-neo-plus-GFP质粒，该质粒编码ACF1或SNF2H-S-H-R-N-A，其表达由四环素可诱导的H1启动子驱动；同时包含新霉素抗性基因与GFP的融合基因，该融合基因由组成型PGK启动子驱动表达。

将10微克质粒DNA加入500微升150毫摩尔氯化钠溶液中，涡旋混匀。然后将jet PY试剂按每微克DNA加2微升的比例加入另一含有500微升150毫摩尔氯化钠溶液的离心管中，涡旋混匀。将jet PIE溶液加入DNA中，通过涡旋充分混匀。

室温孵育15分钟。15分钟后，将DNA复合物轻轻加入含有70%至80%融合度的10厘米培养皿中。次日混合T-Rex 293细胞。

在此示例中，将培养基更换为含有每毫升 500 微克 G four 18 的 DMEM 选择性培养基，方法同前。接下来两周内持续观察细胞，并每三至四天更换一次新鲜的选择性培养基，直至出现细胞克隆。

用肉眼识别菌落，并使用彩色标记笔在培养皿底部标记其位置。在显微镜下确认菌落是否充分分离。当菌落生长至无需显微镜即可观察到的大小时，即可进行分离。

为了确保该实验步骤的成功，在菌落分离过程中应选择分离良好的单个菌落。在无菌操作台中，吸除培养皿中的培养基，用 PBS 轻轻冲洗，并彻底吸净所有残留液体。

用移液枪反复吹打，向平板上的一个菌落加入3 µL含EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液，直至细胞从平板上脱落。将细胞转移至24孔板中一个孔内的筛选培养基中。对平板上的其他多个菌落重复此操作。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞铺满孔板。随后将每个原始克隆的细胞分别传代至另一块12孔板中的三个孔中，并于次日继续培养过夜。向其中一块孔板的培养基中更换为含有1微克/毫升多西环素的培养基，该多西环素母液使用双蒸水配制。

将对照组培养板中的培养基更换为不含多西环素的培养基。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育72小时。随后收集一个经处理和一个未经处理孔中的细胞，进行蛋白质印迹分析，以确定ACF1或SNF2H基因敲低的效率，此处展示的是一个代表性结果。

该蛋白印迹使用 SNF2H 和 α-tubulin 的抗体进行染色，后者作为两个克隆的上样对照。克隆编号 4 和编号 5 在多西环素诱导后显示出 SNF2H 的显著降低，因此被选用于后续的基因敲低实验，该实验将在下一段中展示。

第三块培养板中的未处理细胞将用于扩增筛选出的细胞系，随后将这些细胞分装并冻存。为后续诱导ACF或SNF的基因敲低，需在10厘米培养板中使用选择性培养基培养H板细胞，并向其中一半的培养板加入浓度为每毫升1微克的多西环素，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48至72小时。每组培养板需提供足够细胞用于12个6厘米培养板，其中每个时间点需设置两个重复用于DPI检测，另需各一个培养板用于每个样本的蛋白质印迹分析。

诱导后48至72小时，用胰蛋白酶消化各组细胞，计数后，将1.5×10⁶个细胞接种至每孔6厘米的培养皿中，培养基相同，根据需要加入或不加入多西环素。将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，按指示转染细胞。

未处理和多西环素处理的细胞均以四种方式设置三个重复进行转染：第一种为转入空质粒以及表达GFP的质粒；第二种为空质粒与表达SHRA抗性ACF1-GFP或SNF2H-GFP的载体；第三种为转入编码E4的质粒以及表达GFP的质粒；第四种为转入编码E4（全部四种）的质粒与表达SHRA抗性ACF1-GFP或SNF2H-GFP的载体。转染后，将所有培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下培养过夜。

在转染细胞后的次日，从每个样本的一个培养皿中提取蛋白质，用于 Western blot 分析，以确定 ACF1 或 SNF2H 是否被有效敲低，以及 E4F4 在不同样本中是否表达量相等。剩余的 16 个培养皿将用于 DPI 检测。在通风橱中，吸去用于 DPI 检测的培养皿中的培养基，并用 PBS 轻柔地清洗细胞。

加入1 mL用PBS配制的4%多聚甲醛溶液覆盖细胞，在室温下静置固定15分钟，期间不摇动。吸除多聚甲醛溶液，用PBS在室温下振荡洗涤5分钟。重复洗涤两次，共洗涤三次。第三次PBS洗涤后，加入80%乙醇（置于-20°C保存），于-20°C孵育至少1小时。

吸去乙醇，用 PBS 在室温下振荡洗涤细胞两次，每次 5 分钟；随后用含有 0.5% BSA 和 0.05% Tween 20（即 P-B-S-B-T）的 PBS 在室温下振荡洗涤一次，每次 5 分钟。振荡以防止非特异性抗体结合。在 1 毫升含有 10% 小牛血清的 P-B-S-B-T 缓冲液中，室温振荡封闭细胞 20 分钟。

然后用 PBS-T 缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤 5 分钟。将细胞与一抗（本实验中为 E4/4 特异性抗体）在 1 毫升 PBS-T 缓冲液中孵育 1 小时，室温下轻轻振荡。随后用 PBS-T 缓冲液洗涤两次，再用含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤一次，每次洗涤 5 分钟。

接着，向细胞中加入一毫升含适当荧光标记的二抗和0.5微克/毫升BSA的PBS缓冲液（0.1% BSA），DPI的终浓度为孵育40分钟，期间在室温下避光振荡。最后，用PBS洗涤五分钟。

通过抽吸使孔干燥，并将培养板倒置放置额外一小时至过夜，以实现完全干燥，然后用铝箔覆盖，并使用Flora Mount G溶液在细胞上加盖盖玻片。将培养板置于4摄氏度避光保存，直至准备计数。根据本方案中描述的不同处理条件，发生凋亡的细胞核经固定后，使用E4或4特异性抗体及DPI染色，以观察转染细胞的细胞核。

该图展示了表达 E four 或 four 与 GFP 的细胞示例。图 A 显示仅表达对照 GFP 蛋白的情况，图 B 显示 E four 或 four 的表达情况。图 C 显示 DAPI 染色的细胞核，图 D 显示合并图像。白色箭头标记了转染了 GFP 和 E.four 或 four 且细胞核呈现凋亡形态的细胞。红色箭头标记了形状不规则、未被计为凋亡细胞核的细胞核，星号标记了处于有丝分裂阶段或刚刚完成分裂的细胞核。通过 DAPI 染色观察到的浓缩或碎裂细胞核数量被统计，用于计算转染细胞群体中具有凋亡形态的细胞核百分比，以确保实验结果的最佳客观性。

对各样本中凋亡细胞核的计数采用盲法进行，即计数人员不知晓样本的身份信息。本图显示了一个代表性结果。在表达 E4/4 的细胞中观察到更高比例的核异常，证实 E4/4 可诱导细胞死亡。在 E4/4 表达细胞中，当通过 SHRNA 介导的沉默使 ACF1 水平降低时，核异常的比例最高，表明 ACF1 沉默增强了 E4/4 诱导的细胞死亡，即增强了 E4/4 在细胞中的毒性作用。

ACF 表达水平较低并非由 Western 印迹中观察到的 E 四或四水平升高所致。在执行该操作时，重要的是要记住使用 DPI 辅助对凋亡细胞核进行准确计数，并对识别此类细胞核应用严格标准。除本操作外，还可进行克隆形成实验等其他方法，以验证该 DA pse 操作后的结果。

还可以进行其他方法，如共免疫沉淀实验，以回答更多问题。例如，所研究的蛋白质之间是否存在物理相互作用。