制备睾丸细胞悬液的简易高效技术

本视频将介绍一种非常简单且高效的方案，可在仅15分钟内从小鼠、大鼠和豚鼠等啮齿类动物中获得待测组织的单细胞悬液。该方法已应用于小鼠、大鼠和豚鼠的睾丸组织，采用一种机械装置对包膜组织进行解离。经过过滤和染色后，细胞悬液即可用于流式分析。

细胞分析或分选细胞群体的均一性是研究雄性生殖细胞分化过程中生化与分子事件的前提条件。因此，睾丸组织具有超过30种不同类型的细胞，其高度异质性成为研究哺乳动物精子发生分子基础的主要难题之一。为此，已采用多种方法以获得富集或纯化的睾丸细胞群体，包括机械分离法和离心分离法。

任何细胞分离方法的第一步都是制备细胞悬液。然而，现有的方案通常耗时较长，并可能导致短寿命分子（如RNA）的丢失，这对于后续的表达分析是不利的。本文所介绍方案的主要优势在于，它消除了动物处死后至精子阶段特异性分子研究之间的多个步骤，同时仍能确保细胞悬液具有良好的质量和优异的细胞类型代表性。

演示该实验操作的是AL实验室的研究员Ana Rodriguez博士，以及负责流式细胞分析的Federico San Lopez。本实验需要一套小型设备，即meach系统，及其配套的medicon和fcon附件。然而，fcon附件完全可以由相同孔径的尼龙膜替代。

唯一需要的其他材料和试剂包括玻璃涂布棒、两个培养皿、剪刀和镊子，一支三到五毫升的注射器，用于去除肠腔，DMM 培养基中添加 10% 胎牛血清和 NDA。如果计划进行涉及 RNA 操作的后续实验，则所有材料和溶液均应相应处理以执行该方案。将解剖得到的睾丸置于一个 96 毫米的玻璃培养皿中，其中含有 10 毫升添加了补剂的冰冻 DMM 培养基。

取出TAL弗吉尼亚，将去头睾丸切成每边两到三毫米的方形小块。取四到五块这样的组织，放入一次性分离式Medicon装置中，加入一毫升添加了D的培养基，然后在Meta Machine系统中处理50秒。每个Medicon单元包含一个固定的不锈钢筛网，上面约有一百个六边形孔，每个孔周围环绕着六个微型刀片。

组织由 medicon 腔室内的金属转子送至每个孔，并在通过锋利的孔和金属筛网时被分散解离，同时筛网下方的微型泵提供液体并冲出组织残渣。使用3至5毫升无针头的注射器从medicon中收集细胞悬液。随后，用0.5毫升培养基浸润50微米的Falcon筛网或同等规格的尼龙筛网（孔径约40微米），并将细胞悬液经此筛网过滤。

重复该步骤，但使用25微米尼龙滤网或等效的Falcon装置，并将其置于冰上。取一份细胞悬液样本，在血细胞计数板中进行计数，并用培养基将细胞浓度调整至每毫升1×10⁷至2×10⁷个细胞。最后，加入NDA至终浓度为0.2%，以防止细胞聚集，并避免在后续流式分析过程中发生管路堵塞。如需评估细胞活力，可在流式细胞术分析前，按照生产商说明书使用动物细胞活/死活力检测试剂盒，并加入荧光染料进行检测。

荧光染料的选择将取决于可用的激光器。在本演示中，将展示多种结合DNA的染料的应用。尽管碘化丙啶在低浓度下通常是用于固定细胞或死细胞的常规染料，但我们发现，当其在高浓度下使用时，会进入通过本方法制备的悬浮液中的未固定睾丸细胞。

这可能是由于所涉及的机械应力所致，这种应力结合半上皮组织的感觉特性，可能在轻微操作下即导致细胞间连接桥的断裂。进行碘化丙啶染色时，在样本分析前10分钟，向细胞悬液中加入终浓度为50微克/毫升的碘化丙啶溶液，并在0摄氏度避光孵育。用于分析碘化丙啶染色的细胞。为进一步分选，我们使用配备有调谐至488纳米发射波长的相干氩离子激光器的FACSVantage流式细胞仪。激光功率设定为100毫瓦，碘化丙啶发出的荧光通过FL2检测器收集，使用575/26带通滤光片。

使用70微米喷嘴进行流式细胞术检测，并使用SQUA软件分析以下参数：前向散射、侧向散射、总发射荧光（即脉冲面积）以及荧光发射持续时间（即脉冲宽度）。结果以克为单位呈现，表示每个荧光强度水平的事件数量，同时以D图形式展示侧向散射与荧光脉冲面积的关系，以及荧光脉冲面积与其宽度的关系。

使用荧光脉冲面积与脉冲宽度的双联图（DO图），在正常R或正常C模式下，通过FACSVantage设定的分选模式对SM单核细胞群进行分选，并以三个已分选的液滴作为包络，从而排除双联体。调整样品压差，使细胞分析速率为每秒500至1500个。使用制冷装置将样品管和收集管保持在3至4摄氏度。

或者，可使用其他荧光染料对悬液中的细胞进行染色。例如，活体染料Hoechst 33342可用于终浓度为每毫升5微克，在37摄氏度避光孵育至少10分钟，以用于Hirsch染色。

3、3、3、4、2 染色样本。细胞分析采用配备紫外激发波长激光器（功率25毫瓦）和70微米喷嘴的MO流式细胞仪进行。使用Summit 4.3软件或类似软件分析之前所述的相同参数，当在相差光学显微镜下观察细胞悬液时，可观察到切割质量良好的悬液。

本方案的主要优势首先在于使用多种机械方法制备睾丸细胞悬液，整个过程仅需15分钟，包括睾丸切开、组织切割、匀浆、机械处理和过滤等步骤，该时间约为其他常规方案所需时间的八分之一。本方案耗时短，且操作步骤极少，因此能够良好地保存短寿命大分子，当需要获取原始细胞群体中化合物的代表性样本时，这一点尤为关键。由于该方法涉及的操作极少，因此在本表格中具有良好的可重复性。

以下示例展示了通过流式细胞术分析成年大鼠进行的七次独立实验中不同睾丸细胞群体的相对百分比，以说明该方法的可重复性。与目前制备睾丸细胞悬液所常用的大多数颗粒不同，本文所述方法不涉及酶的作用。尽管通常使用的酶（如胶原酶）有助于组织解离，但它们可能对目标大分子的保存产生不利影响。

无需酶处理不仅有利于RNA和蛋白质的保存，还能降低实验成本。尽管此前有报道称，机械法制备的细胞悬液比胰蛋白酶处理的更容易发生聚集，但我们发现，该方案在无酶作用的条件下仍能获得分散良好的细胞悬液。添加NDA已被证明在防止细胞聚集方面非常有效。

当样本接受流式细胞分析时，观察到的细胞碎片极少，这进一步证明了悬液具有良好的质量。根据已发表的信息，无论是仅通过机械法制备细胞悬液，还是在胰蛋白酶存在下制备，约有13%的圆形精子表现为多核现象。然而，许多机器制备的悬液中多核现象极为稀少，最可能的原因是减少了组织缠结；据指出，多核现象的产生主要是组织操作所致。

本图展示了一个由多种机器制备的大鼠睾丸细胞悬液示例。可见，细胞质保存良好，不同啮齿类动物睾丸组织经多种机器制备所得细胞悬液中二倍体（C2）和四倍体（C4）细胞群体的相对百分比，与完整睾丸组织中的情况相似。

这支持了本文所述方法不会选择性损伤任何特定细胞类型的假设。令人惊讶的是，与传统的滴落制备方法相比，许多机器制备的悬液中细胞类型的代表性得以更好地保留。如图所示，经本方法处理的睾丸细胞悬液所获得的细胞图谱与此前报道的结果并无显著差异。

事实上，所获得的直方图和点图显示了根据DNA含量区分的三个典型的四倍体（4C）到二倍体（2C）睾丸细胞群体，以及一个明显的亚单倍体（subhaploid）群体，后者代表高度浓缩的单倍体精子细胞。这些图谱无论是对成年还是幼年样本，以及无论是使用 Hoechst 染色还是碘化丙啶（propidium iodide）染色的悬浮液，均可观察到。基于DNA含量选定的睾丸细胞群体，甚至具有相同DNA含量但染色质凝聚程度不同的亚群（如细线期和粗线期精母细胞），其有丝分裂细胞的分选已成功实现，纯度超过98%。

正如我们在豚鼠睾丸组织悬液中所观察到的，由于该方案未包含RNA处理步骤，分选后的细胞群体仍能获得高质量的RNA，甚至适用于经碘化丙啶染色的细胞群体进行差异基因表达研究。需要指出的是，与其他染料不同，碘化丙啶不仅可染色DNA，还可染色双链RNA；然而，在该豚鼠睾丸组织悬液分析的图示中，使用碘化丙啶与活力周期橙（vibrant cycle orange）——一种特异性DNA染料——平行检测所获得的细胞图谱相似，表明RNA染色并未显著影响流式细胞术直方图的分布模式。

本列表总结了该优化方案的主要优势。本文所述的优化方法可在仅15分钟内完成适用于流式细胞分析的啮齿类动物睾丸细胞悬液的制备，包括睾丸解剖、组织切割及通过ME机器系统进行处理。该方法耗时短、细胞悬液的可重复性更高，且细胞类型比例更理想，因此相较于目前使用的其他更为繁琐且耗时的自制技术，是一种良好的替代方案。

此外，由于该方法涉及的操作步骤极少，且避免了酶和去污剂的使用，因此非常适合用于基因表达研究等精细的下游应用。