评估趾长伸肌的肌肉功能 离体 和胫骨前肌 原位 在小鼠中

本实验的总体目标是准确测定小鼠肢体肌肉的力学特性。通过离体测量趾长伸肌的收缩特性和被动特性，或通过原位测量胫骨前肌的收缩特性，最终可获得有助于深入理解多种肌肉疾病中生理变化的数据，并评估实验性干预措施是否能够增强肌肉功能。该方法可对骨骼肌的收缩特性和被动特性进行全面评估，这两者是骨骼肌机械功能中不可分割的两个方面，对于身体运动至关重要。

因此，肌肉解剖过程的可视化演示至关重要，因为该过程需要大量的技巧和操作。此外，与现有的体外单轴（in vitro SA）等方法相比，NC双评估法在评估大肌肉收缩特性方面的主要优势在于，该方法不会干扰正常的血流和氧供。在肌肉生理学研究中，一个主要关注点是目标肌肉的氧合状态。

在体外进行大块肌肉（如胫骨前肌）的实验时，氧气扩散可能无法到达肌肉中心。该技术的应用可延伸至肌肉疾病的治疗，因为对骨骼肌机械功能的精确测量也可用于评估肌肉疾病的进展，并确定新型基因、细胞及药物干预疗法的治疗效果。本文所述所有动物实验程序均已获得机构动物护理与使用委员会的批准。

这是一项非存活性手术，用于建立离体实验的肌肉测试系统。首先通过将供氧管固定到水套式组织浴槽上来组装组织浴槽。将组装好的浴槽连接到肌肉固定装置上，并将针型阀插入浴槽的排水口。

将气路管和水循环管连接至浴槽。使30摄氏度的水在夹套腔内循环，并让5 psi的气体通过氧管。用任氏缓冲液填充浴槽，并通过持续的气体流动使其达到平衡。

打开仪器并加载DMC软件，以分离EDL肌动脉，在麻醉后将小鼠置于加热垫上。剃除后肢毛发，并通过脚趾夹捏检查麻醉深度。将小鼠固定在解剖板上，剥离腿部皮肤。

使用两枚裁缝针分别固定后肢的足部和股薄肌。在小鼠上方放置加热灯，以维持核心体温在37摄氏度，并在体视显微镜下持续用温热的任氏缓冲液灌注所有暴露的肌肉。解剖皮肤以暴露远端胫骨前肌（TA）肌腱和伸肌韧带，轻柔地去除覆盖在TA肌肉表面的筋膜。切断伸肌韧带以释放远端TA肌腱。

切断远端趾长伸肌（TA）肌腱，并用一小块浸有林格氏液的棉花去除趾长伸肌（TA）肌肉。止住因趾长伸肌（TA）血管破裂引起的出血。接着，使用丝线在趾短伸肌（EDL）肌肉远端肌腱连接处打一个双重重叠结，随后再打一个环结。

然后在股二头肌上做一切口，暴露近端肌腱，并在同一近端肌腱连接处打相同的一组结。使用同一缝合线打一个双重方结。将杠杆臂钩固定在近端或远端的结上。

轻柔地从后肢分离趾长伸肌（EDL）。首先，在缝合结上方切断近端肌腱，并切断肌肉下方的血管组织。然后，在缝合结下方切断远端肌腱。

用一块浸有林格氏液的棉花覆盖暴露的后肢。最后，将钩子连接到杠杆臂上，并使肌肉在电极之间垂直对齐。将远端缝合线固定在固定柱上。

将肌肉浸入林格液缓冲液中，并将静息张力调整至1.0克。让肌肉平衡至少10分钟。为测量EDL肌肉的收缩特性，请在DMC软件中按照此处所示设置以下每个方案的参数。

对于第一个方案，以150赫兹频率刺激EDL肌肉三次，每次刺激之间间隔62秒，以使其稳定。对于第二个方案，让肌肉放松两分钟，然后通过在不同静息张力下刺激EDL肌肉来确定其最佳长度（LN）。使用数显卡尺测量远端和近端结扎点之间肌肉的最佳长度。

让肌肉放松两分钟。对于方案三，将静息张力调整至L₀，测量单次电刺激下的肌肉力量。测定单次收缩张力（pt）、达到峰值张力的时间（TPT）以及pt的半松弛时间。

让肌肉放松两分钟。进行第四项实验方案时，将静息张力调整至LN，测定不同刺激频率下肌肉产生的收缩力。测量肌肉收缩力达到最大强直收缩力时的P NAUGH。

测量 p naugh 的达峰时间与半舒张时间。开始第五步实验方案时，先让肌肉放松五分钟，调整静息张力至 L Naugh，随后施加 10 组离心收缩，每组之间休息两分钟。计算每次离心收缩后 PN 的相对力量损失。

最后，将EDL肌肉从装置上取下，并在缝合处切断肌腱。测定肌肉的湿重，并计算肌肉的横截面积。为测量EDL肌肉的被动特性，解剖对侧EDL肌肉，并按照之前所示方法将其连接到装置上。

在本视频中，对肌肉施加一个六步拉伸方案，以10%的增量将肌肉拉伸至其原始长度的160%。分析应力-应变曲线，以评估EDL肌肉拉伸过程中的黏性特性，并将肌肉保持在原始长度的10%处，测量以下时间范围内的应力松弛速率。首先，使用循环水将温控动物载物台加热至37摄氏度。

打开设备并加载DMC软件。在暴露麻醉小鼠后肢的TA肌后，使用丝线在髌腱周围打一个双重方结。然后在远端TA肌腱的肌腱结合部（MTJ）处，先打一个双重方结，再打一个环结。

使用相同的缝线制作一个约10毫米的环。将动物置于俯卧位，暴露股二头肌。暴露坐骨神经，并在其近端结扎一个双重方结。

在结的上方切断神经，并小心剥离向膝盖方向约五毫米长度的神经。切勿拉伸或损伤神经。按照本视频前面演示的方法准备对侧的胫骨前肌，并用浸有任氏液的棉花覆盖其中一侧后肢。

接下来，将动物俯卧位固定在动物平台上，使用穿过膝部固定针周围髌韧带的缝线打双结，以固定膝关节。随后，将足部固定在SIL防护块上，将动物平台固定到温控载物台上，并调整加热灯位置，以维持动物核心体温在37摄氏度。将电极连接至平台后，将坐骨神经连接至电极，然后在暴露的后肢远端结扎线远端切断胫前肌（TA）肌腱，并将缝线环连接至杠杆臂挂钩上。

用温热的浸有林格缓冲液的棉布覆盖暴露的后肢肌肉，以记录胫骨前肌（TA 肌）的收缩测量数据。使用本视频前面针对趾长伸肌（EDL 肌）演示的 DMC 软件中的参数和方案，并利用该软件分析数据。完成 TA 肌的测量后，将远端 TA 肌腱缝合环从杠杆臂挂钩上取下，按照前述方法测量对侧 TA 肌的收缩特性。动物安乐死后，取出 TA 肌并测定其湿重。

为了计算横截面积，本表展示了4至6月龄正常黑色10号小鼠与肌营养不良蛋白缺陷型（MDX）小鼠EDL肌肉的形态计量学特性。此处显示了来自黑色10号小鼠和MDX小鼠EDL肌肉的代表性收缩性和被动特性，包括瞬时收缩力、比最大强直收缩力、张力达峰时间以及绝对最大强直收缩力的半舒张时间。张力达峰时间和半舒张时间也可根据绝对瞬时收缩力计算得出。

应力-应变曲线和应力松弛速率用于描述趾长伸肌的被动特性。缺乏肌营养不良蛋白对趾长伸肌的收缩性和被动特性具有显著影响。M-D-X-E-D-L 小鼠趾长伸肌的比单收缩力和比强直力均显著降低。

例如，M-D-X-E-D-L 肌肉达到峰值张力的时间显著更快，而其半松弛时间则显著更慢。此外，应力-应变曲线表明，M-D-X-E-D-L 肌肉的刚度显著增加。M-D-X-E-D-L 肌肉在达到峰值应力前也表现出显著更高的抗力，但在峰值应力之后，应力下降得更快。

此外，M-D-X-E-D-L 肌肉的应力松弛速率显著高于黑色10号EDL肌肉。一旦掌握解剖操作，即可在40分钟内完成EDL肌肉收缩特性与被动特性的离体分析。而在方法建立后，可在60分钟内完成双侧TA肌肉收缩特性的原位评估。

该技术为肌肉疾病领域的研究人员评估骨骼肌的收缩性和被动特性奠定了基础，有助于在该操作流程后确定治疗效果。此外，还可进行其他方法，如骨骼肌的组织病理学分析，以回答进一步的问题。例如，实验性治疗对骨骼肌组织病理学的影响。